Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε την πιο πρόσφατη έκδοση του προγράμματος περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Επιπλέον, για να διασφαλιστεί η συνεχής υποστήριξη, αυτός ο ιστότοπος δεν θα περιέχει στυλ και JavaScript.
Ο σκελετικός μυς είναι ένας ετερογενής ιστός που αποτελείται κυρίως από μυοϊνίδια, τα οποία στους ανθρώπους συνήθως ταξινομούνται σε τρεις τύπους: έναν «αργό» (τύπος 1) και δύο «γρήγορο» (τύποι 2Α και 2Χ). Ωστόσο, η ετερογένεια μεταξύ και εντός των παραδοσιακών τύπων μυοϊνιδίων παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Εφαρμόσαμε μεταγραφικές και πρωτεωμικές προσεγγίσεις σε 1050 και 1038 μεμονωμένα μυοϊνίδια από τον ανθρώπινο πλάγιο πλατύ μυ, αντίστοιχα. Η πρωτεωμική μελέτη περιελάμβανε άνδρες, και η μεταγραφική μελέτη περιελάμβανε 10 άνδρες και 2 γυναίκες. Εκτός από τις ισομορφές βαριάς αλυσίδας μυοσίνης, εντοπίσαμε μεταβολικές πρωτεΐνες, ριβοσωμικές πρωτεΐνες και κυτταρικές συνδετικές πρωτεΐνες ως πηγές πολυδιάστατης μεταβλητότητας μεταξύ των μυοϊνιδίων. Επιπλέον, παρά την αναγνώριση συστάδων αργών και γρήγορων ινών, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι οι ίνες τύπου 2Χ είναι φαινοτυπικά αδιάκριτες από άλλες ίνες ταχείας συστολής. Επιπλέον, η ταξινόμηση με βάση τη βαριά αλυσίδα μυοσίνης δεν επαρκεί για να περιγράψει τον φαινότυπο των μυοϊνιδίων στις μυοπάθειες nemaline. Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν πολυδιάστατη ετερογένεια μυοϊνών, με πηγές διακύμανσης που εκτείνονται πέρα από τις ισομορφές βαριάς αλυσίδας μυοσίνης.
Η κυτταρική ετερογένεια είναι ένα εγγενές χαρακτηριστικό όλων των βιολογικών συστημάτων, επιτρέποντας στα κύτταρα να εξειδικεύονται για να καλύπτουν τις διαφορετικές ανάγκες των ιστών και των κυττάρων.1 Η παραδοσιακή άποψη για την ετερογένεια των ινών του σκελετικού μυός ήταν ότι οι κινητικοί νευρώνες ορίζουν τον τύπο της ίνας μέσα σε μια κινητική μονάδα και ότι ο τύπος της ίνας (δηλαδή, τύπος 1, τύπος 2Α και τύπος 2Χ στους ανθρώπους) καθορίζεται από τα χαρακτηριστικά των ισομορφών της βαριάς αλυσίδας μυοσίνης (MYH).2 Αυτό αρχικά βασίστηκε στην αστάθεια του pH ATPάσης,3,4 και αργότερα στη μοριακή έκφραση της MYH.5 Ωστόσο, με την αναγνώριση και την επακόλουθη αποδοχή «μικτών» ινών που συνεκφράζουν πολλαπλές MYH σε ποικίλες αναλογίες, οι ίνες του σκελετικού μυός θεωρούνται όλο και περισσότερο ως ένα συνεχές και όχι ως διακριτοί τύποι ινών.6 Παρά ταύτα, ο τομέας εξακολουθεί να βασίζεται σε μεγάλο βαθμό στην MYH ως τον κύριο ταξινομητή για την ταξινόμηση των μυοϊνών, μια άποψη που πιθανώς επηρεάζεται από τους περιορισμούς και τις σημαντικές προκαταλήψεις των πρώιμων μελετών σε τρωκτικά, των οποίων τα προφίλ έκφρασης της MYH και το εύρος των τύπων ινών διαφέρουν από αυτά στους ανθρώπους.2 Η κατάσταση περιπλέκεται περαιτέρω από το γεγονός ότι διαφορετικοί ανθρώπινοι σκελετικοί μύες εμφανίζουν ένα ευρύ φάσμα τύπων ινών.7 Το Ο πλάγιος πλατύς μυς είναι ένας μικτός μυς με ενδιάμεσο (και επομένως αντιπροσωπευτικό) προφίλ έκφρασης MYH.7 Επιπλέον, η ευκολία δειγματοληψίας τον καθιστά τον καλύτερα μελετημένο μυ στους ανθρώπους.
Έτσι, η αμερόληπτη διερεύνηση της ποικιλομορφίας των σκελετικών μυϊκών ινών χρησιμοποιώντας ισχυρά εργαλεία «ομικής» είναι κρίσιμη αλλά και δύσκολη, εν μέρει λόγω της πολυπύρηνης φύσης των σκελετικών μυϊκών ινών. Ωστόσο, οι τεχνολογίες μεταγραφομικής8,9 και πρωτεωμικής10 έχουν υποστεί μια επανάσταση στην ευαισθησία τα τελευταία χρόνια λόγω διαφόρων τεχνολογικών εξελίξεων, επιτρέποντας την ανάλυση του σκελετικού μυός σε ανάλυση μίας μόνο ίνας. Ως αποτέλεσμα, έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος στον χαρακτηρισμό της ποικιλομορφίας μίας μόνο ίνας και της αντίδρασής τους σε ατροφικά ερεθίσματα και γήρανση11,12,13,14,15,16,17,18. Είναι σημαντικό ότι αυτές οι τεχνολογικές εξελίξεις έχουν κλινικές εφαρμογές, επιτρέποντας πιο λεπτομερή και ακριβή χαρακτηρισμό της δυσλειτουργίας που σχετίζεται με ασθένειες. Για παράδειγμα, η παθοφυσιολογία της μυοπάθειας νεμαλίνης, μιας από τις πιο συχνές κληρονομικές μυϊκές ασθένειες (MIM 605355 και MIM 161800), είναι πολύπλοκη και προκαλεί σύγχυση.19,20 Επομένως, ένας καλύτερος χαρακτηρισμός της δυσλειτουργίας των σκελετικών μυϊκών ινών θα μπορούσε να οδηγήσει σε σημαντικές προόδους στην κατανόηση αυτής της ασθένειας.
Αναπτύξαμε μεθόδους για μεταγραφική και πρωτεωμική ανάλυση μεμονωμένων σκελετικών μυϊκών ινών που απομονώθηκαν χειροκίνητα από δείγματα ανθρώπινης βιοψίας και τις εφαρμόσαμε σε χιλιάδες ίνες, επιτρέποντάς μας να διερευνήσουμε την κυτταρική ετερογένεια των ανθρώπινων σκελετικών μυϊκών ινών. Κατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας, καταδείξαμε τη δύναμη της μεταγραφικής και πρωτεωμικής φαινοτυποποίησης των μυϊκών ινών και εντοπίσαμε μεταβολικές, ριβοσωμικές και κυτταρικές συνδετικές πρωτεΐνες ως σημαντικές πηγές μεταβλητότητας μεταξύ των ινών. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας αυτήν την πρωτεωμική ροή εργασίας, χαρακτηρίσαμε την κλινική σημασία της νηματώδους μυοπάθειας σε μεμονωμένες σκελετικές μυϊκές ίνες, αποκαλύπτοντας μια συντονισμένη μετατόπιση προς μη οξειδωτικές ίνες ανεξάρτητα από τον τύπο ίνας με βάση την MYH.
Για να διερευνήσουμε την ετερογένεια των ανθρώπινων σκελετικών μυϊκών ινών, αναπτύξαμε δύο ροές εργασίας για να επιτρέψουμε την ανάλυση μεταγραφώματος και πρωτεώματος μεμονωμένων σκελετικών μυϊκών ινών (Σχήμα 1Α και Συμπληρωματικό Σχήμα 1Α). Αναπτύξαμε και βελτιστοποιήσαμε διάφορα μεθοδολογικά βήματα, από την αποθήκευση δειγμάτων και τη διατήρηση της ακεραιότητας του RNA και της πρωτεΐνης έως τη βελτιστοποίηση της απόδοσης για κάθε προσέγγιση. Για την ανάλυση μεταγραφώματος, αυτό επιτεύχθηκε με την εισαγωγή μοριακών γραμμωτών κωδικών ειδικών για το δείγμα στο αρχικό βήμα της αντίστροφης μεταγραφής, επιτρέποντας τη συγκέντρωση 96 ινών για αποτελεσματική επεξεργασία κατάντη. Η βαθύτερη αλληλούχιση (±1 εκατομμύριο αναγνώσεις ανά ίνα) σε σύγκριση με τις παραδοσιακές προσεγγίσεις ενός κυττάρου εμπλούτισε περαιτέρω τα δεδομένα μεταγραφώματος.21 Για την πρωτεωμική, χρησιμοποιήσαμε μια σύντομη χρωματογραφική κλίση (21 λεπτά) σε συνδυασμό με την απόκτηση δεδομένων DIA-PASEF σε ένα φασματόμετρο μάζας timsTOF για τη βελτιστοποίηση του βάθους του πρωτεώματος διατηρώντας παράλληλα υψηλή απόδοση. 22,23 Για να διερευνήσουμε την ετερογένεια των υγιών σκελετικών μυϊκών ινών, χαρακτηρίσαμε τα μεταγραφώματα 1.050 μεμονωμένων ινών από 14 υγιείς ενήλικες δότες και τα πρωτεώματα 1.038 ινών από 5 υγιείς ενήλικες δότες (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Σε αυτή την εργασία, αυτά τα σύνολα δεδομένων αναφέρονται ως μεταγραφώματα και πρωτεώματα των 1.000 ινών, αντίστοιχα. Η προσέγγισή μας ανίχνευσε συνολικά 27.237 μεταγραφές και 2.983 πρωτεΐνες στις μεταγραφικές και πρωτεωμικές αναλύσεις των 1.000 ινών (Σχήμα 1Α, Συμπληρωματικά Σύνολα Δεδομένων 1-2). Μετά το φιλτράρισμα των μεταγραφικών και πρωτεωμικών συνόλων δεδομένων για >1.000 ανιχνευμένα γονίδια και 50% έγκυρες τιμές ανά ίνα, πραγματοποιήθηκαν επακόλουθες βιοπληροφορικές αναλύσεις για 925 και 974 ίνες στο μεταγραφώμα και το πρωτεώμα, αντίστοιχα. Μετά το φιλτράρισμα, ανιχνεύθηκαν κατά μέσο όρο 4257 ± 1557 γονίδια και 2015 ± 234 πρωτεΐνες (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση) ανά ίνα, με περιορισμένη μεταβλητότητα μεταξύ των ατόμων (Συμπληρωματικά Σχήματα 1B–C, Συμπληρωματικά Σύνολα Δεδομένων 3–4). Ωστόσο, η μεταβλητότητα εντός του ατόμου ήταν πιο έντονη μεταξύ των συμμετεχόντων, πιθανώς λόγω διαφορών στην απόδοση RNA/πρωτεΐνης μεταξύ ινών διαφορετικών μηκών και διατομών. Για τις περισσότερες πρωτεΐνες (>2000), ο συντελεστής μεταβλητότητας ήταν κάτω από 20% (Συμπληρωματικό Σχήμα 1D). Και οι δύο μέθοδοι επέτρεψαν τη λήψη ενός ευρέος δυναμικού εύρους μεταγραφών και πρωτεϊνών με έντονα εκφρασμένες υπογραφές σημαντικές για τη μυϊκή συστολή (π.χ., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Συμπληρωματικά Σχήματα 1E–F). Τα περισσότερα από τα αναγνωρισμένα χαρακτηριστικά ήταν κοινά μεταξύ των μεταγραφικών και πρωτεωμικών συνόλων δεδομένων (Συμπληρωματικό Σχήμα 1G) και οι μέσες εντάσεις UMI/LFQ αυτών των χαρακτηριστικών συσχετίστηκαν αρκετά καλά (r = 0,52) (Συμπληρωματικό Σχήμα 1H).
Ροή εργασίας μεταγραφωμικής και πρωτεωμικής (δημιουργήθηκε με το BioRender.com). BD Καμπύλες δυναμικού εύρους για MYH7, MYH2 και MYH1, και υπολογισμένα κατώφλια για την αντιστοίχιση τύπου ινών. E, F Κατανομή της έκφρασης MYH μεταξύ ινών σε σύνολα δεδομένων μεταγραφωμικής και πρωτεωμικής. G, H Διαγράμματα Ομοιόμορφης Προσέγγισης και Προβολής Ποικιλότητας (UMAP) για μεταγραφωμικές και πρωτεωμικές χρωματισμένες ανά τύπο ίνας που βασίζεται σε MYH. I, J Διαγράμματα χαρακτηριστικών που δείχνουν την έκφραση MYH7, MYH2 και MYH1 σε σύνολα δεδομένων μεταγραφωμικής και πρωτεωμικής.
Αρχικά, θέσαμε ως στόχο να αντιστοιχίσουμε τον τύπο ίνας που βασίζεται σε MYH σε κάθε ίνα χρησιμοποιώντας μια βελτιστοποιημένη προσέγγιση που εκμεταλλεύεται την υψηλή ευαισθησία και το δυναμικό εύρος της έκφρασης MYH σε σύνολα δεδομένων omics. Προηγούμενες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει αυθαίρετα κατώφλια για να επισημάνουν τις ίνες ως καθαρές τύπου 1, τύπου 2Α, τύπου 2X ή μικτές με βάση ένα σταθερό ποσοστό έκφρασης διαφορετικών MYH11,14,24. Χρησιμοποιήσαμε μια διαφορετική προσέγγιση στην οποία η έκφραση κάθε ίνας κατατάχθηκε από τις MYH που χρησιμοποιήσαμε για να τυποποιήσουμε τις ίνες: MYH7, MYH2 και MYH1, που αντιστοιχούν στις ίνες τύπου 1, τύπου 2Α και τύπου 2X, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, υπολογίσαμε μαθηματικά το χαμηλότερο σημείο καμπής κάθε προκύπτουσας καμπύλης και το χρησιμοποιήσαμε ως κατώφλι για να αντιστοιχίσουμε τις ίνες ως θετικές (πάνω από το κατώφλι) ή αρνητικές (κάτω από το κατώφλι) για κάθε MYH (Σχήμα 1B–D). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι οι MYH7 (Σχήμα 1B) και MYH2 (Σχήμα 1C) έχουν πιο διακριτά προφίλ έκφρασης on/off σε επίπεδο RNA σε σύγκριση με το επίπεδο πρωτεΐνης. Πράγματι, σε επίπεδο πρωτεΐνης, πολύ λίγες ίνες δεν εξέφραζαν την MYH7 και καμία ίνα δεν είχε 100% έκφραση MYH2. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε προκαθορισμένα κατώφλια έκφρασης για να αντιστοιχίσουμε τύπους ινών που βασίζονται σε MYH σε όλες τις ίνες σε κάθε σύνολο δεδομένων. Για παράδειγμα, οι ίνες MYH7+/MYH2-/MYH1- αντιστοιχίστηκαν στον τύπο 1, ενώ οι ίνες MYH7-/MYH2+/MYH1+ αντιστοιχίστηκαν στον μικτό τύπο 2A/2X (βλ. Συμπληρωματικό Πίνακα 2 για πλήρη περιγραφή). Συγκεντρώνοντας όλες τις ίνες, παρατηρήσαμε μια αξιοσημείωτα παρόμοια κατανομή των τύπων ινών που βασίζονται σε MYH τόσο σε επίπεδα RNA (Σχήμα 1Ε) όσο και σε επίπεδα πρωτεΐνης (Σχήμα 1F), ενώ η σχετική σύνθεση των τύπων ινών που βασίζονται σε MYH ποικίλλει μεταξύ των ατόμων, όπως αναμενόταν (Συμπληρωματικό Σχήμα 2Α). Οι περισσότερες ίνες ταξινομήθηκαν είτε ως καθαρές τύπου 1 (34-35%) είτε ως τύπου 2A (36-38%), αν και ανιχνεύθηκε επίσης σημαντικός αριθμός μικτών ινών τύπου 2A/2X (16-19%). Μια εντυπωσιακή διαφορά είναι ότι οι καθαρές ίνες τύπου 2X μπορούσαν να ανιχνευθούν μόνο σε επίπεδο RNA, αλλά όχι σε επίπεδο πρωτεΐνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ταχεία έκφραση MYH ρυθμίζεται τουλάχιστον εν μέρει μετά τη μεταγραφή.
Επικυρώσαμε τη μέθοδο τυποποίησης ινών MYH που βασίζεται στην πρωτεωμική χρησιμοποιώντας dot blotting με βάση αντισώματα και και οι δύο μέθοδοι πέτυχαν 100% συμφωνία στην αναγνώριση καθαρών ινών τύπου 1 και τύπου 2Α (βλ. Συμπληρωματικό Σχήμα 2Β). Ωστόσο, η προσέγγιση που βασίζεται στην πρωτεωμική ήταν πιο ευαίσθητη, πιο αποτελεσματική στην αναγνώριση μικτών ινών και στην ποσοτικοποίηση της αναλογίας κάθε γονιδίου MYH σε κάθε ίνα. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν την αποτελεσματικότητα της χρήσης μιας αντικειμενικής, εξαιρετικά ευαίσθητης προσέγγισης που βασίζεται στην ομική για τον χαρακτηρισμό τύπων ινών του σκελετικού μυός.
Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε τις συνδυασμένες πληροφορίες που παρείχαν η μεταγραφομική και η πρωτεωμική για να ταξινομήσουμε αντικειμενικά τις μυϊκές ίνες με βάση το πλήρες μεταγραφόμημά τους ή το πρωτεόμημά τους. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ομοιόμορφης πολλαπλής προσέγγισης και προβολής (UMAP) για να μειώσουμε τη διαστασιολόγηση σε έξι κύρια συστατικά (Συμπληρωματικά Σχήματα 3Α-Β), καταφέραμε να απεικονίσουμε τη μεταβλητότητα των μυϊκών ινών στο μεταγραφόμημα (Σχήμα 1G) και το πρωτεόμημα (Σχήμα 1H). Αξιοσημείωτα, οι μυϊκές ίνες δεν ομαδοποιήθηκαν ανά συμμετέχοντες (Συμπληρωματικά Σχήματα 3C-D) ή ημέρες δοκιμής (Συμπληρωματικό Σχήμα 3E) ούτε στα σύνολα δεδομένων μεταγραφομικής ούτε στα σύνολα δεδομένων πρωτεωμικής, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μεταβλητότητα εντός του ατόμου στις σκελετικές μυϊκές ίνες είναι υψηλότερη από τη μεταβλητότητα μεταξύ των ατόμων. Στο διάγραμμα UMAP, προέκυψαν δύο διακριτές συστάδες που αντιπροσωπεύουν τις «γρήγορες» και «αργές» μυϊκές ίνες (Σχήματα 1G-H). Οι μυϊκές ίνες MYH7+ (αργές) συγκεντρώθηκαν στον θετικό πόλο του UMAP1, ενώ οι μυϊκές ίνες MYH2+ και MYH1+ (γρήγορες) συγκεντρώθηκαν στον αρνητικό πόλο του UMAP1 (Σχήματα 1I-J). Ωστόσο, δεν έγινε διάκριση μεταξύ των τύπων ινών ταχείας συστολής (δηλαδή, τύπος 2A, τύπος 2X ή μικτή 2A/2X) με βάση την έκφραση MYH, γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκφραση MYH1 (Σχήμα 1I-J) ή άλλων κλασικών δεικτών μυϊκών ινών 2X όπως οι ACTN3 ή MYLK2 (Συμπληρωματικά Σχήματα 4A-B) δεν διαφοροποιεί μεταξύ διαφορετικών τύπων μυϊκών ινών όταν εξετάζεται ολόκληρο το μεταγραφόμωμα ή το πρωτέωμα. Επιπλέον, σε σύγκριση με τις MYH2 και MYH7, λίγα μεταγραφήματα ή πρωτεΐνες συσχετίστηκαν θετικά με το MYH1 (Συμπληρωματικά Σχήματα 4C-H), υποδηλώνοντας ότι η αφθονία του MYH1 δεν αντικατοπτρίζει πλήρως το μεταγραφόμωμα/πρωτεώμα μυϊκής ίνας. Παρόμοια συμπεράσματα εξήχθησαν κατά την αξιολόγηση της μικτής έκφρασης των τριών ισομορφών MYH σε επίπεδο UMAP (Συμπληρωματικά Σχήματα 4I-J). Έτσι, ενώ οι ίνες 2X μπορούν να ταυτοποιηθούν σε επίπεδο μεταγραφής μόνο με βάση την ποσοτικοποίηση MYH, οι ίνες MYH1+ δεν διακρίνονται από άλλες γρήγορες ίνες όταν εξετάζεται ολόκληρο το μεταγραφόμημα ή το πρωτέωμα.
Ως αρχική διερεύνηση της ετερογένειας των αργών ινών πέρα από την MYH, αξιολογήσαμε τέσσερις καθιερωμένες πρωτεΐνες ειδικού τύπου αργών ινών: TPM3, TNNT1, MYL3 και ATP2A22. Οι υποτύποι αργών ινών έδειξαν υψηλές, αν και όχι τέλειες, συσχετίσεις Pearson με την MYH7 τόσο στην μεταγραφωμική (Συμπληρωματικό Σχήμα 5Α) όσο και στην πρωτεωμική (Συμπληρωματικό Σχήμα 5Β). Περίπου το 25% και το 33% των αργών ινών δεν ταξινομήθηκαν ως καθαρές αργές ίνες από όλους τους υποτύπους γονιδίων/πρωτεϊνών στην μεταγραφωμική (Συμπληρωματικό Σχήμα 5C) και την πρωτεωμική (Συμπληρωματικό Σχήμα 5D), αντίστοιχα. Επομένως, η ταξινόμηση αργών ινών που βασίζεται σε πολλαπλούς υποτύπους γονιδίων/πρωτεϊνών εισάγει πρόσθετη πολυπλοκότητα, ακόμη και για πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι είναι ειδικές για τον τύπο των ινών. Αυτό υποδηλώνει ότι η ταξινόμηση ινών που βασίζεται σε ισομορφές μιας μόνο οικογένειας γονιδίων/πρωτεϊνών μπορεί να μην αντικατοπτρίζει επαρκώς την πραγματική ετερογένεια των σκελετικών μυϊκών ινών.
Για να διερευνήσουμε περαιτέρω τη φαινοτυπική μεταβλητότητα των ανθρώπινων σκελετικών μυϊκών ινών στην κλίμακα ολόκληρου του μοντέλου omics, πραγματοποιήσαμε αμερόληπτη μείωση διαστάσεων των δεδομένων χρησιμοποιώντας ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) (Σχήμα 2Α). Παρόμοια με τα διαγράμματα UMAP, ούτε ο συμμετέχων ούτε η ημέρα δοκιμής επηρέασαν την ομαδοποίηση ινών σε επίπεδο PCA (Συμπληρωματικά Σχήματα 6Α-Γ). Και στα δύο σύνολα δεδομένων, ο τύπος ινών που βασίζεται σε MYH εξηγήθηκε από το PC2, το οποίο έδειξε μια συστάδα ινών αργής συστολής τύπου 1 και μια δεύτερη συστάδα που περιείχε ίνες ταχείας συστολής τύπου 2Α, τύπου 2Χ και μικτές ίνες 2Α/2Χ (Σχήμα 2Α). Και στα δύο σύνολα δεδομένων, αυτές οι δύο συστάδες συνδέονταν με έναν μικρό αριθμό ινών μικτού τύπου 1/2Α. Όπως αναμενόταν, η ανάλυση υπερεκπροσώπησης των κύριων παραγόντων PC επιβεβαίωσε ότι το PC2 καθοδηγούνταν από συσταλτικές και μεταβολικές υπογραφές (Σχήμα 2Β και Συμπληρωματικά Σχήματα 6Δ-Ε, Συμπληρωματικά Σύνολα Δεδομένων 5-6). Συνολικά, ο τύπος ίνας που βασίζεται στο MYH βρέθηκε να είναι επαρκής για να εξηγήσει τη συνεχή μεταβολή κατά μήκος του PC2, με εξαίρεση τις λεγόμενες ίνες 2X που κατανεμήθηκαν σε όλο το μεταγραφόγραμμα εντός του γρήγορου συμπλέγματος.
Α. Διαγράμματα ανάλυσης κύριων συνιστωσών (PCA) συνόλων δεδομένων μεταγραφώματος και πρωτεώματος χρωματισμένα σύμφωνα με τον τύπο ίνας με βάση το MYH. Β. Ανάλυση εμπλουτισμού των οδηγών μεταγραφής και πρωτεΐνης σε PC2 και PC1. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο clusterProfiler και τις προσαρμοσμένες τιμές p του Benjamini-Hochberg. C, D. Διαγράμματα PCA χρωματισμένα σύμφωνα με τους όρους οντολογίας γονιδίων διακυτταρικής προσκόλλησης (GO) στους όρους GO του μεταγραφώματος και του κοσταμερίου στο πρωτέωμα. Τα βέλη αντιπροσωπεύουν τους οδηγούς μεταγραφής και πρωτεΐνης και τις κατευθύνσεις τους. E, F. Διαγράμματα χαρακτηριστικών ομοιόμορφης πολλαπλής προσέγγισης και προβολής (UMAP) κλινικά σχετικών χαρακτηριστικών που δείχνουν διαβαθμίσεις έκφρασης ανεξάρτητα από τον τύπο αργής/γρήγορης ίνας. G, H. Συσχετίσεις μεταξύ των οδηγών PC2 και PC1 σε μεταγραφώματα και πρωτεώματα.
Απροσδόκητα, ο τύπος μυϊκής ίνας που βασίζεται σε MYH εξήγησε μόνο τον δεύτερο υψηλότερο βαθμό μεταβλητότητας (PC2), υποδηλώνοντας ότι άλλοι βιολογικοί παράγοντες που δεν σχετίζονται με τον τύπο μυϊκής ίνας που βασίζεται σε MYH (PC1) παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ετερογένειας των ινών των σκελετικών μυών. Η ανάλυση υπερεκπροσώπησης των κορυφαίων παραγόντων στην PC1 αποκάλυψε ότι η μεταβλητότητα στην PC1 καθορίστηκε κυρίως από την προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου και την περιεκτικότητα σε ριβοσώματα στο μεταγραφόμωμα, και από τα κοσταμερή και τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες στο πρωτεόμωμα (Σχήμα 2Β και Συμπληρωματικά Σχήματα 6D-E, Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 7). Στον σκελετικό μυ, τα κοσταμερή συνδέουν τον δίσκο Ζ με το σαρκολέμμα και εμπλέκονται στη μετάδοση δύναμης και στη σηματοδότηση. 25 Σχολιασμένα διαγράμματα PCA που χρησιμοποιούν χαρακτηριστικά προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου (μεταγραφόμημα, Σχήμα 2C) και κοσταμερίου (πρωτεώμμα, Σχήμα 2D) αποκάλυψαν μια ισχυρή μετατόπιση προς τα αριστερά στην PC1, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα χαρακτηριστικά είναι εμπλουτισμένα σε ορισμένες ίνες.
Μια πιο λεπτομερής εξέταση της ομαδοποίησης μυοϊνών σε επίπεδο UMAP αποκάλυψε ότι τα περισσότερα χαρακτηριστικά εμφάνισαν μια ανεξάρτητη από τον τύπο μυοϊνών κλίση έκφρασης βασισμένη σε MYH και όχι ειδική για την υποομάδα μυοϊνών. Αυτή η συνέχεια παρατηρήθηκε για πολλά γονίδια που σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις (Σχήμα 2Ε), όπως CHCHD10 (νευρομυϊκή νόσος), SLIT3 (μυϊκή ατροφία), CTDNEP1 (μυϊκή νόσος). Αυτή η συνέχεια παρατηρήθηκε επίσης σε όλο το πρωτέωμα, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών που σχετίζονται με νευρολογικές διαταραχές (UGDH), σηματοδότηση ινσουλίνης (PHIP) και μεταγραφή (HIST1H2AB) (Σχήμα 2F). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν συνέχεια στην ανεξάρτητη από τον τύπο ινών ετερογένεια αργής/γρήγορης συστολής σε διαφορετικές μυϊκές ίνες.
Είναι ενδιαφέρον ότι τα γονίδια-οδηγοί στο PC2 έδειξαν καλή συσχέτιση μεταγραφώματος-πρωτεώματος (r = 0,663) (Σχήμα 2G), υποδηλώνοντας ότι οι τύποι ινών αργής και ταχείας συστολής, και ιδιαίτερα οι συσταλτικές και μεταβολικές ιδιότητες των σκελετικών μυϊκών ινών, ρυθμίζονται μεταγραφικά. Ωστόσο, τα γονίδια-οδηγοί στο PC1 δεν έδειξαν συσχέτιση μεταγραφώματος-πρωτεώματος (r = -0,027) (Σχήμα 2H), υποδηλώνοντας ότι οι παραλλαγές που δεν σχετίζονται με τους τύπους ινών αργής/ταχείας συστολής ρυθμίζονται σε μεγάλο βαθμό μετα-μεταγραφικά. Επειδή οι παραλλαγές στο PC1 εξηγήθηκαν κυρίως από τους όρους της οντολογίας των ριβοσωμικών γονιδίων, και δεδομένου ότι τα ριβοσώματα παίζουν κρίσιμο και εξειδικευμένο ρόλο στο κύτταρο συμμετέχοντας ενεργά και επηρεάζοντας τη μετάφραση πρωτεϊνών,31 στη συνέχεια ξεκινήσαμε να διερευνήσουμε αυτήν την απροσδόκητη ριβοσωμική ετερογένεια.
Αρχικά χρωματίσαμε το διάγραμμα ανάλυσης κύριων συστατικών πρωτεωμικής σύμφωνα με τη σχετική αφθονία πρωτεϊνών στον όρο GOCC "κυτταροπλασμικό ριβόσωμα" (Σχήμα 3Α). Αν και αυτός ο όρος είναι εμπλουτισμένος στη θετική πλευρά του PC1, με αποτέλεσμα μια μικρή κλίση, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες οδηγούν την κατανομή και στις δύο κατευθύνσεις του PC1 (Σχήμα 3Α). Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες που εμπλουτίστηκαν στην αρνητική πλευρά του PC1 περιελάμβαναν τις RPL18, RPS18 και RPS13 (Σχήμα 3Β), ενώ οι RPL31, RPL35 και RPL38 (Σχήμα 3C) ήταν οι κύριοι παράγοντες στη θετική πλευρά του PC1. Είναι ενδιαφέρον ότι οι RPL38 και RPS13 εκφράστηκαν σε υψηλό βαθμό στον σκελετικό μυ σε σύγκριση με άλλους ιστούς (Συμπληρωματικό Σχήμα 7Α). Αυτές οι διακριτικές ριβοσωμικές υπογραφές στο PC1 δεν παρατηρήθηκαν στο μεταγραφόγραμμα (Συμπληρωματικό Σχήμα 7Β), υποδεικνύοντας μετα-μεταγραφική ρύθμιση.
Α. Διάγραμμα ανάλυσης κύριων συστατικών (PCA) χρωματισμένο σύμφωνα με τους όρους της κυτταροπλασματικής ριβοσωμικής γονιδιακής οντολογίας (GO) σε όλο το πρωτέωμα. Τα βέλη υποδεικνύουν την κατεύθυνση της διακύμανσης που προκαλείται από πρωτεΐνες στο διάγραμμα PCA. Το μήκος της γραμμής αντιστοιχεί στη βαθμολογία κύριων συστατικών για μια δεδομένη πρωτεΐνη. Β, Γ. Διαγράμματα χαρακτηριστικών PCA για RPS13 και RPL38. Δ. Μη επιβλεπόμενη ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης κυτταροπλασματικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Ε. Δομικό μοντέλο του ριβοσώματος 80S (PDB: 4V6X) που επισημαίνει ριβοσωμικές πρωτεΐνες με διαφορετικές αφθονίες στις ίνες του σκελετικού μυός. ΣΤ. Ριβοσωμικές πρωτεΐνες με διαφορετική στοιχειομετρία εντοπισμένες κοντά στο κανάλι εξόδου του mRNA.
Οι έννοιες της ριβοσωμικής ετερογένειας και εξειδίκευσης έχουν προταθεί προηγουμένως, όπου η παρουσία διακριτών υποπληθυσμών ριβοσωμάτων (ριβοσωμική ετερογένεια) μπορεί να επηρεάσει άμεσα την πρωτεϊνική μετάφραση σε διαφορετικούς ιστούς32 και κύτταρα33 μέσω της επιλεκτικής μετάφρασης συγκεκριμένων ομάδων μεταγράφων mRNA34 (εξειδίκευση ριβοσωμάτων). Για να εντοπίσουμε υποπληθυσμούς ριβοσωμικών πρωτεϊνών που συνεκφράζονται σε ίνες σκελετικού μυός, πραγματοποιήσαμε μια μη επιβλεπόμενη ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης ριβοσωμικών πρωτεϊνών στο πρωτεόμα (Σχήμα 3D, Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 8). Όπως αναμενόταν, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες δεν ομαδοποιήθηκαν ανά τύπο ίνας με βάση το MYH. Ωστόσο, εντοπίσαμε τρεις διακριτές συστάδες ριβοσωμικών πρωτεϊνών. η πρώτη συστάδα (ribosomal_cluster_1) συσχετίζεται με RPL38 και επομένως έχει αυξημένη έκφραση σε ίνες με θετικό προφίλ PC1. Η δεύτερη συστάδα (ribosomal_cluster_2) συσχετίζεται με RPS13 και είναι αυξημένη σε ίνες με αρνητικό προφίλ PC1. Η τρίτη συστάδα (ribosomal_cluster_3) δεν εμφανίζει συντονισμένη διαφορική έκφραση στις ίνες των σκελετικών μυών και μπορεί να θεωρηθεί η «πυρήνας» της ριβοσωμικής πρωτεΐνης των σκελετικών μυών. Και οι δύο ριβοσωμικές συστάδες 1 και 2 περιέχουν ριβοσωμικές πρωτεΐνες που έχουν προηγουμένως αποδειχθεί ότι ρυθμίζουν την εναλλακτική μετάφραση (π.χ., RPL10A, RPL38, RPS19 και RPS25) και επηρεάζουν λειτουργικά την ανάπτυξη (π.χ., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της PCA, η παρατηρούμενη ετερογενής αναπαράσταση αυτών των ριβοσωμικών πρωτεϊνών στις ίνες έδειξε επίσης συνέχεια (Συμπληρωματικό Σχήμα 7C).
Για να απεικονίσουμε τη θέση των ετερογενών ριβοσωμικών πρωτεϊνών εντός του ριβοσώματος, χρησιμοποιήσαμε ένα δομικό μοντέλο του ανθρώπινου ριβοσώματος 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (Σχήμα 3Ε). Μετά την απομόνωση ριβοσωμικών πρωτεϊνών που ανήκουν σε διαφορετικές ριβοσωμικές συστάδες, οι θέσεις τους δεν ήταν στενά ευθυγραμμισμένες, γεγονός που υποδηλώνει ότι η προσέγγισή μας απέτυχε να παρέχει εμπλουτισμό για ορισμένες περιοχές/κλάσματα του ριβοσώματος. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, ότι η αναλογία πρωτεϊνών μεγάλων υπομονάδων στη συστάδα 2 ήταν χαμηλότερη από ό,τι στις συστάδες 1 και 3 (Συμπληρωματικό Σχήμα 7D). Παρατηρήσαμε ότι οι πρωτεΐνες με αλλοιωμένη στοιχειομετρία στις ίνες του σκελετικού μυός εντοπίζονταν κυρίως στην επιφάνεια του ριβοσώματος (Σχήμα 3Ε), σύμφωνα με την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με στοιχεία εσωτερικής θέσης εισόδου ριβοσώματος (IRES) σε διαφορετικούς πληθυσμούς mRNA, συντονίζοντας έτσι την επιλεκτική μετάφραση. 40, 41 Επιπλέον, πολλές πρωτεΐνες με αλλοιωμένη στοιχειομετρία στις ίνες του σκελετικού μυός εντοπίστηκαν κοντά σε λειτουργικές περιοχές όπως η σήραγγα εξόδου του mRNA (Σχήμα 3F), οι οποίες ρυθμίζουν επιλεκτικά την μεταφραστική επιμήκυνση και τη διακοπή συγκεκριμένων πεπτιδίων. 42 Συνοψίζοντας, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η στοιχειομετρία των ριβοσωμικών πρωτεϊνών των σκελετικών μυών παρουσιάζει ετερογένεια, με αποτέλεσμα διαφορές μεταξύ των σκελετικών μυϊκών ινών.
Στη συνέχεια, ξεκινήσαμε να εντοπίσουμε υπογραφές ινών ταχείας και αργής συστολής και να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς της μεταγραφικής τους ρύθμισης. Συγκρίνοντας τις συστάδες ινών ταχείας και αργής συστολής που ορίζονται από το UMAP στα δύο σύνολα δεδομένων (Σχήματα 1G–H και 4A–B), οι μεταγραφικές και πρωτεωμικές αναλύσεις αναγνώρισαν 1366 και 804 διαφορετικά άφθονα χαρακτηριστικά, αντίστοιχα (Σχήματα 4A–B, Συμπληρωματικά Σύνολα Δεδομένων 9–12). Παρατηρήσαμε τις αναμενόμενες διαφορές στις υπογραφές που σχετίζονται με τα σαρκομέρια (π.χ., τροπομυοσίνη και τροπονίνη), τη σύζευξη διέγερσης-συστολής (ισομορφές SERCA) και τον ενεργειακό μεταβολισμό (π.χ., ALDOA και CKB). Επιπλέον, τα αντίγραφα και οι πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την ουβικιτίνη πρωτεϊνών εκφράστηκαν διαφορετικά σε ίνες ταχείας και αργής συστολής (π.χ., USP54, SH3RF2, USP28 και USP48) (Σχήματα 4A–B). Επιπλέον, το γονίδιο μικροβιακής πρωτεΐνης RP11-451G4.2 (DWORF), το οποίο έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι εκφράζεται διαφορικά σε όλους τους τύπους μυϊκών ινών του αρνιού43 και ενισχύει τη δραστηριότητα SERCA στον καρδιακό μυ44, αυξήθηκε σημαντικά στις αργές σκελετικές μυϊκές ίνες (Σχήμα 4Α). Ομοίως, σε επίπεδο μεμονωμένων ινών, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές σε γνωστές υπογραφές όπως οι ισομορφές της γαλακτικής αφυδρογονάσης που σχετίζονται με τον μεταβολισμό (LDHA και LDHB, Σχήμα 4C και Συμπληρωματικό Σχήμα 8Α)45,46 καθώς και προηγουμένως άγνωστες υπογραφές ειδικές για τον τύπο ινών (όπως IRX3, USP54, USP28 και DPYSL3) (Σχήμα 4C). Υπήρξε σημαντική επικάλυψη διαφορικά εκφραζόμενων χαρακτηριστικών μεταξύ των μεταγραφικών και πρωτεωμικών συνόλων δεδομένων (Συμπληρωματικό Σχήμα 8Β), καθώς και μια συσχέτιση αλλαγής πτυχής που οφείλεται κυρίως στην πιο έντονη διαφορική έκφραση των χαρακτηριστικών του σαρκομερίου (Συμπληρωματικό Σχήμα 8C). Αξιοσημείωτα, ορισμένες υπογραφές (π.χ. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) έδειξαν ισχυρή μετα-μεταγραφική ρύθμιση μόνο στο πρωτεωμικό επίπεδο και είχαν προφίλ έκφρασης ειδικών για τον τύπο των ινών αργής/γρήγορης συστολής (Συμπληρωματικό Σχήμα 8C).
Διαγράμματα ηφαιστείου Α και Β που συγκρίνουν αργά και γρήγορα συσσωματώματα, τα οποία προσδιορίστηκαν από τα διαγράμματα ομοιόμορφης πολλαπλής προσέγγισης και προβολής (UMAP) στα Σχήματα 1G–H. Οι έγχρωμες κουκκίδες αντιπροσωπεύουν μεταγραφές ή πρωτεΐνες που διαφέρουν σημαντικά σε FDR < 0,05, και οι πιο σκούρες κουκκίδες αντιπροσωπεύουν μεταγραφές ή πρωτεΐνες που διαφέρουν σημαντικά σε λογαριθμική μεταβολή > 1. Πραγματοποιήθηκε αμφίδρομη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας τη δοκιμή DESeq2 Wald με τιμές p προσαρμοσμένες κατά Benjamini-Hochberg (μεταγραφωμική) ή τη μέθοδο γραμμικού μοντέλου Limma με εμπειρική Bayesian ανάλυση ακολουθούμενη από προσαρμογή Benjamini-Hochberg για πολλαπλές συγκρίσεις (πρωτεωμική). Γ Διαγράμματα υπογραφής επιλεγμένων διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων ή πρωτεϊνών μεταξύ αργών και γρήγορων ινών. Δ Ανάλυση εμπλουτισμού σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενων μεταγραφών και πρωτεϊνών. Οι επικαλυπτόμενες τιμές εμπλουτίζονται και στα δύο σύνολα δεδομένων, οι τιμές μεταγραφώματος εμπλουτίζονται μόνο στο μεταγραφώμα και οι τιμές πρωτεώματος εμπλουτίζονται μόνο στο πρωτεώμα. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο clusterProfiler με τιμές p προσαρμοσμένες κατά Benjamini-Hochberg. Ε. Παράγοντες μεταγραφής ειδικοί για τον τύπο ινών που προσδιορίστηκαν από το SCENIC με βάση τις βαθμολογίες ειδικότητας ρυθμιστή που προέρχονται από το SCENIC και τη διαφορική έκφραση mRNA μεταξύ των τύπων ινών. ΣΤ. Καταγραφή επιλεγμένων παραγόντων μεταγραφής που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ αργών και γρήγορων ινών.
Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση υπερεκπροσώπησης γονιδίων και πρωτεϊνών που αντιπροσωπεύονται διαφορετικά (Σχήμα 4D, Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 13). Ο εμπλουτισμός των οδών για χαρακτηριστικά που διέφεραν μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων αποκάλυψε αναμενόμενες διαφορές, όπως οι διεργασίες β-οξείδωσης λιπαρών οξέων και μεταβολισμού κετονών (αργές ίνες), η μυϊκή συστολή/σύσπαση μυών (γρήγορες και αργές ίνες, αντίστοιχα) και οι καταβολικές διεργασίες υδατανθράκων (γρήγορες ίνες). Η δραστικότητα της πρωτεϊνικής φωσφατάσης σερίνης/θρεονίνης ήταν επίσης αυξημένη στις γρήγορες ίνες, λόγω χαρακτηριστικών όπως οι ρυθμιστικές και καταλυτικές υπομονάδες φωσφατάσης (PPP3CB, PPP1R3D και PPP1R3A), οι οποίες είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν τον μεταβολισμό του γλυκογόνου (47) (Συμπληρωματικά Σχήματα 8D–E). Άλλες οδοί εμπλουτισμένες με γρήγορες ίνες περιελάμβαναν σωμάτια επεξεργασίας (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) στο πρωτεόμα (Συμπληρωματικό Σχήμα 8F), που ενδεχομένως εμπλέκονται στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση (48), και στη δραστικότητα του μεταγραφικού παράγοντα (SREBF1, RXRG, RORA) στο μεταγραφόμα (Συμπληρωματικό Σχήμα 8G). Οι αργές ίνες εμπλουτίστηκαν σε δραστικότητα οξειδοαναγωγάσης (BDH1, DCXR, TXN2) (Συμπληρωματικό Σχήμα 8H), δέσμευση αμιδίου (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Συμπληρωματικό Σχήμα 8I), εξωκυτταρική μήτρα (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Συμπληρωματικό Σχήμα 8J) και δραστικότητα υποδοχέα-συνδέτη (FNDC5, SPX, NENF) (Συμπληρωματικό Σχήμα 8K).
Για να αποκτήσουμε περαιτέρω εικόνα της μεταγραφικής ρύθμισης που διέπει τα χαρακτηριστικά του τύπου αργών/γρήγορων μυϊκών ινών, πραγματοποιήσαμε ανάλυση εμπλουτισμού παραγόντων μεταγραφής χρησιμοποιώντας το SCENIC49 (Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 14). Πολλοί παράγοντες μεταγραφής εμπλουτίστηκαν σημαντικά μεταξύ γρήγορων και αργών μυϊκών ινών (Σχήμα 4Ε). Σε αυτούς περιλαμβάνονταν παράγοντες μεταγραφής όπως ο MAFA, ο οποίος έχει προηγουμένως συνδεθεί με την ταχεία ανάπτυξη μυϊκών ινών,50 καθώς και αρκετοί παράγοντες μεταγραφής που δεν είχαν προηγουμένως συσχετιστεί με γονιδιακά προγράμματα ειδικών για τον τύπο μυϊκών ινών. Μεταξύ αυτών, οι PITX1, EGR1 και MYF6 ήταν οι πιο εμπλουτισμένοι παράγοντες μεταγραφής στις γρήγορες μυϊκές ίνες (Σχήμα 4Ε). Αντίθετα, οι ZSCAN30 και EPAS1 (επίσης γνωστοί ως HIF2A) ήταν οι πιο εμπλουτισμένοι παράγοντες μεταγραφής στις αργές μυϊκές ίνες (Σχήμα 4Ε). Σύμφωνα με αυτό, ο MAFA εκφράστηκε σε υψηλότερα επίπεδα στην περιοχή UMAP που αντιστοιχεί στις γρήγορες μυϊκές ίνες, ενώ ο EPAS1 είχε το αντίθετο μοτίβο έκφρασης (Σχήμα 4F).
Εκτός από τα γνωστά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, υπάρχουν πολυάριθμοι μη κωδικοποιητικοί βιότυποι RNA που μπορεί να εμπλέκονται στη ρύθμιση της ανθρώπινης ανάπτυξης και των ασθενειών. 51, 52 Σε σύνολα δεδομένων μεταγραφώματος, αρκετά μη κωδικοποιητικά RNA εμφανίζουν εξειδίκευση τύπου ινών (Σχήμα 5Α και Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 15), συμπεριλαμβανομένου του LINC01405, το οποίο είναι ιδιαίτερα ειδικό για τις αργές ίνες και αναφέρεται ότι μειώνεται στους μύες από ασθενείς με μιτοχονδριακή μυοπάθεια. 53 Αντίθετα, το RP11-255P5.3, που αντιστοιχεί στο γονίδιο lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, εμφανίζει εξειδίκευση τύπου γρήγορης ίνας. Τόσο το LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) όσο και το RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) παρουσιάζουν εξειδίκευση για τον σκελετικό μυ (Συμπληρωματικά Σχήματα 9Α-Β) και δεν έχουν γνωστά συσταλτικά γονίδια εντός της γονιδιωματικής τους γειτονιάς μήκους 1 Mb, γεγονός που υποδηλώνει ότι παίζουν εξειδικευμένο ρόλο στη ρύθμιση των τύπων ινών αντί για τη ρύθμιση των γειτονικών συσταλτικών γονιδίων. Τα προφίλ έκφρασης αργής/γρήγορης ίνας, ειδικά για τον τύπο ινών, των LINC01405 και RP11-255P5.3, αντίστοιχα, επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας το RNAscope (Σχήματα 5Β-Γ).
Α. Τα μη κωδικοποιητικά αντίγραφα RNA ρυθμίζονται σημαντικά σε μυϊκές ίνες αργής και ταχείας συστολής. Β. Αντιπροσωπευτικές εικόνες RNAscope που δείχνουν την εξειδίκευση του τύπου ινών αργής και ταχείας συστολής των LINC01405 και RP11-255P5.3, αντίστοιχα. Γραμμή κλίμακας = 50 μm. Γ. Ποσοτικοποίηση της έκφρασης μη κωδικοποιητικού RNA ειδικού για τον τύπο μυϊκών ινών, όπως προσδιορίστηκε από το RNAscope (n = 3 βιοψίες από ανεξάρτητα άτομα, συγκρίνοντας γρήγορες και αργές μυϊκές ίνες σε κάθε άτομο). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα t-test διπλής ουράς Student's. Τα διαγράμματα κουτιών δείχνουν τη διάμεση τιμή και το πρώτο και τρίτο τεταρτημόριο, με τα μουστάκια να δείχνουν τις ελάχιστες και μέγιστες τιμές. Δ. Ροή εργασίας de novo ταυτοποίησης μικροβιακής πρωτεΐνης (δημιουργήθηκε με το BioRender.com). Ε. Η μικροβιακή πρωτεΐνη LINC01405_ORF408:17441:17358 εκφράζεται ειδικά σε αργές σκελετικές μυϊκές ίνες (n = 5 βιοψίες από ανεξάρτητους συμμετέχοντες, συγκρίνοντας γρήγορες και αργές μυϊκές ίνες σε κάθε συμμετέχοντα). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο γραμμικού μοντέλου Limm σε συνδυασμό με μια εμπειρική Bayesian προσέγγιση, ακολουθούμενη από τη μέθοδο Benjamini-Hochberg για πολλαπλές συγκρίσεις με προσαρμογή p-value. Τα γραφήματα κουτιών δείχνουν τη διάμεση, το πρώτο και το τρίτο τεταρτημόριο, με τις λεπτές γραμμές να δείχνουν προς τις μέγιστες/ελάχιστες τιμές.
Πρόσφατα, μελέτες έχουν δείξει ότι πολλά υποτιθέμενα μη κωδικοποιητικά αντίγραφα κωδικοποιούν μεταγραμμένες μικροβιακές πρωτεΐνες, μερικές από τις οποίες ρυθμίζουν τη μυϊκή λειτουργία. 44, 55 Για να εντοπίσουμε μικροβιακές πρωτεΐνες με πιθανή εξειδίκευση τύπου ινών, αναζητήσαμε το σύνολο δεδομένων πρωτεώματος 1000 ινών χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο αρχείο FASTA που περιείχε τις αλληλουχίες μη κωδικοποιητικών αντιγράφων (n = 305) που βρέθηκαν στο σύνολο δεδομένων μεταγραφώματος 1000 ινών (Σχήμα 5D). Εντοπίσαμε 197 μικροβιακές πρωτεΐνες από 22 διαφορετικά αντίγραφα, 71 από τα οποία ρυθμίζονταν διαφορετικά μεταξύ αργών και γρήγορων σκελετικών μυϊκών ινών (Συμπληρωματικό Σχήμα 9C και Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 16). Για το LINC01405, εντοπίστηκαν τρία μικροβιακά πρωτεϊνικά προϊόντα, ένα από τα οποία έδειξε παρόμοια εξειδίκευση αργής ίνας με το αντίγραφό του (Σχήμα 5Ε και Συμπληρωματικό Σχήμα 9D). Έτσι, εντοπίσαμε το LINC01405 ως γονίδιο που κωδικοποιεί μια μικροβιακή πρωτεΐνη ειδική για αργές σκελετικές μυϊκές ίνες.
Αναπτύξαμε μια ολοκληρωμένη ροή εργασίας για τον πρωτεωμικό χαρακτηρισμό μεγάλης κλίμακας μεμονωμένων μυϊκών ινών και εντοπίσαμε ρυθμιστές της ετερογένειας των ινών σε υγιείς καταστάσεις. Εφαρμόσαμε αυτήν τη ροή εργασίας για να κατανοήσουμε πώς οι μυοπάθειες νεμαλίνης επηρεάζουν την ετερογένεια των ινών των σκελετικών μυών. Οι μυοπάθειες νεμαλίνης είναι κληρονομικές μυϊκές ασθένειες που προκαλούν μυϊκή αδυναμία και, σε παιδιά που έχουν προσβληθεί, παρουσιάζουν μια σειρά από επιπλοκές, όπως αναπνευστική δυσχέρεια, σκολίωση και περιορισμένη κινητικότητα των άκρων. 19,20 Συνήθως, στις μυοπάθειες νεμαλίνης, παθογόνες παραλλαγές σε γονίδια όπως η ακτίνη άλφα 1 (ACTA1) έχουν ως αποτέλεσμα την κυριαρχία της σύνθεσης μυοϊνών ινών βραδείας συστολής, αν και αυτό το φαινόμενο είναι ετερογενές. Μια αξιοσημείωτη εξαίρεση είναι η μυοπάθεια νεμαλίνης τροπονίνης Τ1 (TNNT1), η οποία έχει την κυριαρχία των γρήγορων ινών. Έτσι, η καλύτερη κατανόηση της ετερογένειας που υποκρύπτεται στη δυσλειτουργία των ινών των σκελετικών μυών που παρατηρείται στις μυοπάθειες νεμαλίνης μπορεί να βοηθήσει στην αποκάλυψη της πολύπλοκης σχέσης μεταξύ αυτών των ασθενειών και του τύπου των μυοϊνών.
Σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (n = 3 ανά ομάδα), οι μυϊκές ίνες που απομονώθηκαν από ασθενείς με μυοπάθεια νεμαλίνης με μεταλλάξεις στα γονίδια ACTA1 και TNNT1 έδειξαν έντονη ατροφία ή δυστροφία των μυϊκών ινών (Σχήμα 6Α, Συμπληρωματικός Πίνακας 3). Αυτό παρουσίασε σημαντικές τεχνικές προκλήσεις για την πρωτεωμική ανάλυση λόγω της περιορισμένης ποσότητας διαθέσιμου υλικού. Παρά ταύτα, καταφέραμε να ανιχνεύσουμε 2485 πρωτεΐνες σε 272 σκελετικές μυϊκές ίνες. Μετά το φιλτράρισμα για τουλάχιστον 1000 ποσοτικοποιημένες πρωτεΐνες ανά ίνα, 250 ίνες υποβλήθηκαν σε επακόλουθη βιοπληροφορική ανάλυση. Μετά το φιλτράρισμα, ποσοτικοποιήθηκαν κατά μέσο όρο 1573 ± 359 πρωτεΐνες ανά ίνα (Συμπληρωματικό Σχήμα 10Α, Συμπληρωματικά Σύνολα Δεδομένων 17-18). Αξιοσημείωτα, παρά τη σημαντική μείωση του μεγέθους των ινών, το βάθος του πρωτεώματος των δειγμάτων ασθενών με μυοπάθεια νεμαλίνης μειώθηκε μόνο μέτρια. Επιπλέον, η επεξεργασία αυτών των δεδομένων χρησιμοποιώντας τα δικά μας αρχεία FASTA (συμπεριλαμβανομένων μη κωδικοποιητικών μεταγραφών) μας επέτρεψε να εντοπίσουμε πέντε μικροβιακές πρωτεΐνες σε σκελετικές μυϊκές ίνες από ασθενείς με μυοπάθεια νεμαλίνης (Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 19). Το δυναμικό εύρος του πρωτεώματος ήταν σημαντικά ευρύτερο και οι συνολικές πρωτεΐνες στην ομάδα ελέγχου συσχετίστηκαν καλά με τα αποτελέσματα μιας προηγούμενης ανάλυσης πρωτεώματος 1000 ινών (Συμπληρωματικό Σχήμα 10Β-Γ).
Α. Μικροσκοπικές εικόνες που δείχνουν ατροφία ή δυστροφία των ινών και την κυριαρχία διαφορετικών τύπων ινών με βάση την MYH σε μυοπάθειες nemaline (NM) ACTA1 και TNNT1. Γραμμή κλίμακας = 100 μm. Για να διασφαλιστεί η αναπαραγωγιμότητα της χρώσης σε ασθενείς με ACTA1 και TNNT1, τρεις βιοψίες ασθενών χρωματίστηκαν δύο έως τρεις φορές (τέσσερις τομές ανά περίπτωση) πριν από την επιλογή αντιπροσωπευτικών εικόνων. Β. Αναλογίες τύπων ινών στους συμμετέχοντες με βάση την MYH. Γ. Διάγραμμα ανάλυσης κύριων συνιστωσών (PCA) σκελετικών μυϊκών ινών σε ασθενείς με μυοπάθειες nemaline και ομάδες ελέγχου. Δ. Σκελετικές μυϊκές ίνες από ασθενείς με μυοπάθειες nemaline και ομάδες ελέγχου που προβάλλονται σε διάγραμμα PCA που προσδιορίστηκε από τις 1000 ίνες που αναλύθηκαν στο Σχήμα 2. Για παράδειγμα, διαγράμματα ηφαιστείου που συγκρίνουν τις διαφορές μεταξύ συμμετεχόντων με μυοπάθειες nemaline ACTA1 και TNNT1 και ομάδων ελέγχου, και μεταξύ συμμετεχόντων με μυοπάθειες nemaline ACTA1 και TNNT1. Οι έγχρωμοι κύκλοι υποδηλώνουν πρωτεΐνες που ήταν σημαντικά διαφορετικές σε π < 0,05, και οι σκούρες κουκκίδες υποδηλώνουν πρωτεΐνες που ήταν σημαντικά διαφορετικές σε FDR < 0,05. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο γραμμικού μοντέλου Limma και εμπειρικές Bayesian μεθόδους, ακολουθούμενη από προσαρμογή της τιμής p για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Benjamini-Hochberg. H. Ανάλυση εμπλουτισμού πρωτεϊνών με σημαντική διαφορική έκφραση σε ολόκληρο το πρωτέωμα και σε ίνες τύπου 1 και 2Α. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο clusterProfiler και τιμές p προσαρμοσμένες από Benjamini-Hochberg. I, J. Διαγράμματα ανάλυσης κύριων συνιστωσών (PCA) χρωματισμένα με όρους εξωκυτταρικής μήτρας και οντολογίας μιτοχονδριακών γονιδίων (GO).
Επειδή οι μυοπάθειες νεμαλίνης μπορούν να επηρεάσουν την αναλογία των τύπων μυϊκών ινών που εκφράζουν MYH στον σκελετικό μυ,19,20 εξετάσαμε αρχικά τους τύπους μυϊκών ινών που εκφράζουν MYH σε ασθενείς με μυοπάθειες νεμαλίνης και σε ομάδες ελέγχου. Προσδιορίσαμε τον τύπο μυϊκών ινών χρησιμοποιώντας μια αμερόληπτη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως για τη δοκιμασία 1000 μυϊκών ινών (Συμπληρωματικά Σχήματα 10D-E) και πάλι αποτύχαμε να εντοπίσουμε καθαρές μυϊκές ίνες 2X (Σχήμα 6Β). Παρατηρήσαμε μια ετερογενή επίδραση των μυοπαθειών νεμαλίνης στον τύπο μυϊκών ινών, καθώς δύο ασθενείς με μεταλλάξεις ACTA1 είχαν αυξημένη αναλογία μυϊκών ινών τύπου 1, ενώ δύο ασθενείς με μυοπάθεια νεμαλίνης TNNT1 είχαν μειωμένη αναλογία μυϊκών ινών τύπου 1 (Σχήμα 6Β). Πράγματι, η έκφραση του MYH2 και των ισομορφών ταχείας τροπονίνης (TNNC2, TNNI2 και TNNT3) μειώθηκε στις μυοπάθειες ACTA1-νεμαλίνης, ενώ η έκφραση του MYH7 μειώθηκε στις μυοπάθειες TNNT1-νεμαλίνης (Συμπληρωματικό Σχήμα 11Α). Αυτό συμφωνεί με προηγούμενες αναφορές ετερογενούς αλλαγής τύπου μυοϊνών σε μυοπάθειες νεμαλίνης.19,20 Επιβεβαιώσαμε αυτά τα αποτελέσματα με ανοσοϊστοχημεία και διαπιστώσαμε ότι οι ασθενείς με μυοπάθεια ACTA1-νεμαλίνης είχαν κυριαρχία μυοϊνών τύπου 1, ενώ οι ασθενείς με μυοπάθεια TNNT1-νεμαλίνης είχαν το αντίθετο πρότυπο (Σχήμα 6Α).
Σε επίπεδο πρωτεώματος μίας ίνας, οι σκελετικές μυϊκές ίνες από ασθενείς με μυοπάθεια ACTA1 και TNNT1 nemaline ομαδοποιήθηκαν με την πλειονότητα των ινών ελέγχου, με τις ίνες μυοπάθειας TNNT1 nemaline να είναι γενικά οι πιο σοβαρά επηρεασμένες (Σχήμα 6C). Αυτό ήταν ιδιαίτερα εμφανές κατά την απεικόνιση διαγραμμάτων ανάλυσης κύριων συνιστωσών (PCA) ψευδο-διογκωμένων ινών για κάθε ασθενή, με τους ασθενείς 2 και 3 με μυοπάθεια TNNT1 nemaline να εμφανίζονται πιο απομακρυσμένοι από τα δείγματα ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχήμα 11B, Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 20). Για να κατανοήσουμε καλύτερα πώς οι ίνες από ασθενείς με μυοπάθεια συγκρίνονται με τις υγιείς ίνες, χρησιμοποιήσαμε λεπτομερείς πληροφορίες που ελήφθησαν από πρωτεωμική ανάλυση 1.000 ινών από υγιείς ενήλικες συμμετέχοντες. Προβάλαμε ίνες από το σύνολο δεδομένων μυοπάθειας (ασθενείς με μυοπάθεια ACTA1 και TNNT1 nemaline και ομάδες ελέγχου) στο διάγραμμα PCA που ελήφθη από την πρωτεωμική ανάλυση 1000 ινών (Σχήμα 6D). Η κατανομή των τύπων ινών MYH κατά μήκος του PC2 στις ίνες ελέγχου ήταν παρόμοια με την κατανομή ινών που ελήφθη από την πρωτεωμική ανάλυση 1000 ινών. Ωστόσο, οι περισσότερες ίνες σε ασθενείς με μυοπάθεια νεμαλίνης μετατοπίστηκαν προς τα κάτω στο PC2, επικαλύπτοντας με υγιείς ίνες ταχείας συστολής, ανεξάρτητα από τον εγγενή τύπο ινών MYH. Έτσι, αν και οι ασθενείς με μυοπάθεια νεμαλίνης ACTA1 έδειξαν μετατόπιση προς τις ίνες τύπου 1 όταν ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μεθόδους που βασίζονται στο MYH, τόσο η μυοπάθεια νεμαλίνης ACTA1 όσο και η μυοπάθεια νεμαλίνης TNNT1 μετατόπισαν το πρωτεώμα των σκελετικών μυϊκών ινών προς τις ίνες ταχείας συστολής.
Στη συνέχεια, συγκρίναμε απευθείας κάθε ομάδα ασθενών με υγιείς μάρτυρες και εντοπίσαμε 256 και 552 διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες στις μυοπάθειες νεμαλίνης ACTA1 και TNNT1, αντίστοιχα (Σχήμα 6E-G και Συμπληρωματικό Σχήμα 11C, Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 21). Η ανάλυση εμπλουτισμού γονιδίων αποκάλυψε μια συντονισμένη μείωση στις μιτοχονδριακές πρωτεΐνες (Σχήμα 6H-I, Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 22). Παραδόξως, παρά τη διαφορική κυριαρχία των τύπων ινών στις μυοπάθειες νεμαλίνης ACTA1 και TNNT1, αυτή η μείωση ήταν εντελώς ανεξάρτητη από τον τύπο ινών που βασίζεται σε MYH (Σχήμα 6H και Συμπληρωματικά Σχήματα 11D-I, Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 23). Τρεις μικροβιακές πρωτεΐνες ρυθμίστηκαν επίσης στις μυοπάθειες νεμαλίνης ACTA1 ή TNNT1. Δύο από αυτές τις μικροπρωτεΐνες, η ENSG00000215483_TR14_ORF67 (επίσης γνωστή ως LINC00598 ή Lnc-FOXO1) και η ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), έδειξαν διαφορετική αφθονία μόνο στις μυϊκές ίνες τύπου 1. Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι η ENSG00000215483_TR14_ORF67 παίζει ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. 56 Από την άλλη πλευρά, η ENSG00000232046_TR1_ORF437 (που αντιστοιχεί στην LINC01798) αυξήθηκε τόσο στις μυϊκές ίνες τύπου 1 όσο και στις τύπου 2Α στην μυοπάθεια ACTA1-νεμαλίνης σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (Συμπληρωματικό Σχήμα 12Α, Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 24). Αντίθετα, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες δεν επηρεάστηκαν σε μεγάλο βαθμό από τη μυοπάθεια από νεμαλίνη, αν και η RPS17 υπορυθμίστηκε στη μυοπάθεια από νεμαλίνη ACTA1 (Εικόνα 6Ε).
Η ανάλυση εμπλουτισμού αποκάλυψε επίσης ανοδική ρύθμιση των διεργασιών του ανοσοποιητικού συστήματος στις μυοπάθειες νεμαλίνης ACTA1 και TNNT1, ενώ η κυτταρική προσκόλληση αυξήθηκε επίσης στη μυοπάθεια νεμαλίνης TNNT1 (Σχήμα 6H). Ο εμπλουτισμός αυτών των εξωκυτταρικών παραγόντων αντανακλάται από τις πρωτεΐνες της εξωκυτταρικής μήτρας που μετατοπίζουν την PCA στις PC1 και PC2 σε αρνητική κατεύθυνση (δηλαδή, προς τις πιο επηρεασμένες ίνες) (Σχήμα 6J). Και οι δύο ομάδες ασθενών έδειξαν αυξημένη έκφραση εξωκυτταρικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε ανοσολογικές αποκρίσεις και μηχανισμούς επιδιόρθωσης του σαρκολεμματικού συστήματος, όπως οι αννεξίνες (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 και η πρωτεΐνη που αλληλεπιδρούν μαζί τους S100A1159 (Συμπληρωματικά Σχήματα 12B–C). Αυτή η διαδικασία έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι ενισχύεται στις μυϊκές δυστροφίες60, αλλά, εξ όσων γνωρίζουμε, δεν έχει συσχετιστεί προηγουμένως με μυοπάθειες νεμαλίνης. Η φυσιολογική λειτουργία αυτού του μοριακού μηχανισμού απαιτείται για την επιδιόρθωση του σαρκολεμματικού συστήματος μετά από τραυματισμό και για τη σύντηξη νεοσχηματισμένων μυοκυττάρων με μυϊκές ίνες58,61. Έτσι, η αυξημένη δραστηριότητα αυτής της διαδικασίας και στις δύο ομάδες ασθενών υποδηλώνει μια επανορθωτική απόκριση στον τραυματισμό που προκαλείται από την αστάθεια των μυϊκών ινών.
Οι επιδράσεις κάθε μυοπάθειας από νεμαλίνη ήταν καλά συσχετισμένες (r = 0,736) και έδειξαν λογική επικάλυψη (Συμπληρωματικά Σχήματα 11Α-Β), υποδεικνύοντας ότι η μυοπάθεια από νεμαλίνη ACTA1 και TNNT1 έχουν παρόμοιες επιδράσεις στο πρωτεόμα. Ωστόσο, ορισμένες πρωτεΐνες ρυθμίστηκαν μόνο στη μυοπάθεια από νεμαλίνη ACTA1 ή TNNT1 (Συμπληρωματικά Σχήματα 11Α και C). Η προϊνωτική πρωτεΐνη MFAP4 ήταν μία από τις πρωτεΐνες με τη μεγαλύτερη αύξηση στη μυοπάθεια από νεμαλίνη TNNT1, αλλά παρέμεινε αμετάβλητη στη μυοπάθεια από νεμαλίνη ACTA1. Η SKIC8, ένα συστατικό του συμπλόκου PAF1C που είναι υπεύθυνο για τη ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου HOX, ήταν μειωμένη στη μυοπάθεια από νεμαλίνη TNNT1, αλλά δεν επηρεάστηκε στη μυοπάθεια από νεμαλίνη ACTA1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 11Α). Η άμεση σύγκριση της μυοπάθειας από νεμαλίνη ACTA1 και TNNT1 αποκάλυψε μεγαλύτερες μειώσεις στις μιτοχονδριακές πρωτεΐνες και αυξήσεις στις πρωτεΐνες του ανοσοποιητικού συστήματος στη μυοπάθεια από νεμαλίνη TNNT1 (Σχήμα 6G–H και Συμπληρωματικά Σχήματα 11C και 11H–I). Αυτά τα δεδομένα συμφωνούν με τη μεγαλύτερη ατροφία/δυστροφία που παρατηρήθηκε στη μυοπάθεια από νεμαλίνη TNNT1 σε σύγκριση με τη μυοπάθεια από νεμαλίνη TNNT1 (Σχήμα 6Α), υποδηλώνοντας ότι η μυοπάθεια από νεμαλίνη TNNT1 αντιπροσωπεύει μια πιο σοβαρή μορφή της νόσου.
Για να αξιολογήσουμε εάν οι παρατηρούμενες επιδράσεις της μυοπάθειας από νεμαλίνη επιμένουν σε ολόκληρο το μυϊκό επίπεδο, πραγματοποιήσαμε μια μαζική πρωτεωμική ανάλυση μυϊκών βιοψιών από την ίδια ομάδα ασθενών με μυοπάθεια από νεμαλίνη TNNT1 και τις συγκρίναμε με ομάδες ελέγχου (n = 3 ανά ομάδα) (Συμπληρωματικό Σχήμα 13Α, Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 25). Όπως αναμενόταν, οι ομάδες ελέγχου ήταν στενά συνδεδεμένες στην ανάλυση κύριων συστατικών, ενώ οι ασθενείς με μυοπάθεια από νεμαλίνη TNNT1 εμφάνισαν υψηλότερη μεταβλητότητα μεταξύ των δειγμάτων παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε στην ανάλυση μεμονωμένων ινών (Συμπληρωματικό Σχήμα 13Β). Η μαζική ανάλυση αναπαρήγαγε τις διαφορικά εκφραζόμενες πρωτεΐνες (Συμπληρωματικό Σχήμα 13C, Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 26) και τις βιολογικές διεργασίες (Συμπληρωματικό Σχήμα 13D, Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 27) που επισημάνθηκαν συγκρίνοντας μεμονωμένες ίνες, αλλά έχασαν την ικανότητα να διακρίνουν μεταξύ διαφορετικών τύπων ινών και απέτυχαν να λάβουν υπόψη τις ετερογενείς επιδράσεις της νόσου σε όλες τις ίνες.
Συνολικά, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η πρωτεωμική μεμονωμένων μυοϊνών μπορεί να διασαφηνίσει κλινικά βιολογικά χαρακτηριστικά που δεν ανιχνεύονται με στοχευμένες μεθόδους όπως η ανοσοαποτύπωση. Επιπλέον, αυτά τα δεδομένα υπογραμμίζουν τους περιορισμούς της χρήσης μόνο της τυποποίησης ινών ακτίνης (MYH) για την περιγραφή της φαινοτυπικής προσαρμογής. Πράγματι, αν και η εναλλαγή τύπου ινών διαφέρει μεταξύ των μυοπαθειών ακτίνης και τροπονίνης nemaline, και οι δύο μυοπάθειες nemaline αποσυνδέουν την τυποποίηση ινών MYH από τον μεταβολισμό των ινών των σκελετικών μυών προς ένα ταχύτερο και λιγότερο οξειδωτικό μυϊκό πρωτέωμα.
Η κυτταρική ετερογένεια είναι κρίσιμη για τους ιστούς ώστε να ανταποκρίνονται στις ποικίλες απαιτήσεις τους. Στους σκελετικούς μύες, αυτό συχνά περιγράφεται ως τύποι ινών που χαρακτηρίζονται από διαφορετικούς βαθμούς παραγωγής δύναμης και κόπωσης. Ωστόσο, είναι σαφές ότι αυτό εξηγεί μόνο ένα μικρό μέρος της μεταβλητότητας των σκελετικών μυϊκών ινών, η οποία είναι πολύ πιο μεταβλητή, πολύπλοκη και πολύπλευρη από ό,τι πιστεύαμε προηγουμένως. Οι τεχνολογικές εξελίξεις έχουν πλέον ρίξει φως στους παράγοντες που ρυθμίζουν τις σκελετικές μυϊκές ίνες. Πράγματι, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι οι ίνες τύπου 2X μπορεί να μην αποτελούν ξεχωριστό υποτύπο σκελετικών μυϊκών ινών. Επιπλέον, εντοπίσαμε μεταβολικές πρωτεΐνες, ριβοσωμικές πρωτεΐνες και πρωτεΐνες που σχετίζονται με τα κύτταρα ως κύριους καθοριστικούς παράγοντες της ετερογένειας των σκελετικών μυϊκών ινών. Εφαρμόζοντας τη ροή εργασίας της πρωτεωμικής μας σε δείγματα ασθενών με νηματώδη μυοπάθεια, καταδείξαμε περαιτέρω ότι η τυποποίηση ινών που βασίζεται σε MYH δεν αντικατοπτρίζει πλήρως την ετερογένεια των σκελετικών μυών, ειδικά όταν το σύστημα διαταράσσεται. Πράγματι, ανεξάρτητα από τον τύπο ινών που βασίζεται σε MYH, η νηματώδης μυοπάθεια έχει ως αποτέλεσμα μια μετατόπιση προς ταχύτερες και λιγότερο οξειδωτικές ίνες.
Οι ίνες του σκελετικού μυός έχουν ταξινομηθεί από τον 19ο αιώνα. Πρόσφατες αναλύσεις ομικής μας έχουν επιτρέψει να αρχίσουμε να κατανοούμε τα προφίλ έκφρασης διαφορετικών τύπων ινών MYH και τις αντιδράσεις τους σε διαφορετικά ερεθίσματα. Όπως περιγράφεται εδώ, οι προσεγγίσεις ομικής έχουν επίσης το πλεονέκτημα της μεγαλύτερης ευαισθησίας για την ποσοτικοποίηση δεικτών τύπου ινών από τις παραδοσιακές μεθόδους που βασίζονται σε αντισώματα, χωρίς να βασιζόμαστε στην ποσοτικοποίηση ενός (ή μερικών) δεικτών για τον ορισμό ενός τύπου ινών του σκελετικού μυός. Χρησιμοποιήσαμε συμπληρωματικές μεταγραφικές και πρωτεωμικές ροές εργασίας και ενσωματώσαμε τα αποτελέσματα για να εξετάσουμε τη μεταγραφική και μετα-μεταγραφική ρύθμιση της ετερογένειας των ινών στις ανθρώπινες σκελετικές μυϊκές ίνες. Αυτή η ροή εργασίας είχε ως αποτέλεσμα την αποτυχία ταυτοποίησης καθαρών ινών τύπου 2X σε επίπεδο πρωτεΐνης στον έξω πλατύ μυ της ομάδας μας υγιών νεαρών ανδρών. Αυτό συμφωνεί με προηγούμενες μελέτες μεμονωμένων ινών που βρήκαν <1% καθαρές ίνες 2X σε υγιή έξω πλατύ μυ, αν και αυτό θα πρέπει να επιβεβαιωθεί σε άλλους μύες στο μέλλον. Η ασυμφωνία μεταξύ της ανίχνευσης σχεδόν καθαρών ινών 2X σε επίπεδο mRNA και μόνο μικτών ινών 2A/2X σε επίπεδο πρωτεΐνης είναι αινιγματική. Η έκφραση του mRNA της ισομορφής MYH δεν είναι κιρκαδική,67 γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι απίθανο να έχουμε «χάσει» το σήμα έναρξης του MYH2 σε φαινομενικά καθαρές ίνες 2X σε επίπεδο RNA. Μια πιθανή εξήγηση, αν και καθαρά υποθετική, θα μπορούσε να είναι οι διαφορές στη σταθερότητα της πρωτεΐνης ή/και του mRNA μεταξύ των ισομορφών MYH. Πράγματι, καμία γρήγορη ίνα δεν είναι 100% καθαρή για οποιαδήποτε ισομορφή MYH και δεν είναι σαφές εάν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του MYH1 στην περιοχή 70-90% θα οδηγούσαν σε ίση αφθονία MYH1 και MYH2 σε επίπεδο πρωτεΐνης. Ωστόσο, όταν εξετάζεται ολόκληρο το μεταγραφόμωμα ή το πρωτέωμα, η ανάλυση συστάδων μπορεί να αναγνωρίσει με βεβαιότητα μόνο δύο διακριτές συστάδες που αντιπροσωπεύουν αργές και γρήγορες σκελετικές μυϊκές ίνες, ανεξάρτητα από την ακριβή σύνθεσή τους με MYH. Αυτό συνάδει με τις αναλύσεις που χρησιμοποιούν μονοπύρηνες μεταγραφικές προσεγγίσεις, οι οποίες συνήθως αναγνωρίζουν μόνο δύο διακριτές μυοπυρηνικές συστάδες. 68, 69, 70 Επιπλέον, αν και προηγούμενες πρωτεωμικές μελέτες έχουν εντοπίσει ίνες τύπου 2X, αυτές οι ίνες δεν ομαδοποιούνται ξεχωριστά από τις υπόλοιπες γρήγορες ίνες και εμφανίζουν μόνο έναν μικρό αριθμό πρωτεϊνών με διαφορετική αφθονία σε σύγκριση με άλλους τύπους ινών που βασίζονται στην MYH. 14 Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι θα πρέπει να επιστρέψουμε στην άποψη των αρχών του 20ού αιώνα για την ταξινόμηση των μυϊκών ινών, η οποία διαίρεσε τις ανθρώπινες σκελετικές μυϊκές ίνες όχι σε τρεις διακριτές κατηγορίες με βάση την MYH, αλλά σε δύο συστάδες με βάση τις μεταβολικές και συσταλτικές τους ιδιότητες. 63
Το πιο σημαντικό είναι ότι η ετερογένεια των μυϊκών ινών θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη σε πολλαπλές διαστάσεις. Προηγούμενες μελέτες «ομικής» έχουν δείξει προς αυτή την κατεύθυνση, υποδηλώνοντας ότι οι ίνες του σκελετικού μυός δεν σχηματίζουν διακριτές συστάδες αλλά είναι διατεταγμένες κατά μήκος ενός συνεχούς. 11, 13, 14, 64, 71 Εδώ, δείχνουμε ότι, εκτός από τις διαφορές στις συσταλτικές και μεταβολικές ιδιότητες του σκελετικού μυός, οι μυϊκές ίνες μπορούν να διαφοροποιηθούν από χαρακτηριστικά που σχετίζονται με τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου και τους μηχανισμούς μετάφρασης. Πράγματι, διαπιστώσαμε ετερογένεια ριβοσωμάτων στις ίνες του σκελετικού μυός που συμβάλλει στην ετερογένεια ανεξάρτητα από τους τύπους αργών και γρήγορων ινών. Η υποκείμενη αιτία αυτής της σημαντικής ετερογένειας των μυϊκών ινών, ανεξάρτητη από τον τύπο αργών και γρήγορων ινών, παραμένει ασαφής, αλλά μπορεί να υποδεικνύει εξειδικευμένη χωρική οργάνωση εντός των μυϊκών δεσμίδων που ανταποκρίνονται βέλτιστα σε συγκεκριμένες δυνάμεις και φορτία,72 εξειδικευμένη κυτταρική ή οργανοειδική επικοινωνία με άλλους τύπους κυττάρων στο μυϊκό μικροπεριβάλλον73,74,75 ή διαφορές στη δραστηριότητα των ριβοσωμάτων εντός μεμονωμένων μυϊκών ινών. Πράγματι, η ριβοσωμική ετεροπλασμία, είτε μέσω παράλογης υποκατάστασης των RPL3 και RPL3L είτε στο επίπεδο της 2'O-μεθυλίωσης του rRNA, έχει αποδειχθεί ότι σχετίζεται με την υπερτροφία των σκελετικών μυών76,77. Οι πολυομικές και χωρικές εφαρμογές σε συνδυασμό με τον λειτουργικό χαρακτηρισμό μεμονωμένων μυϊκών ινών θα προωθήσουν περαιτέρω την κατανόησή μας για τη μυϊκή βιολογία σε πολυομικό επίπεδο78.
Αναλύοντας τα πρωτεώματα μεμονωμένων μυοϊνών από ασθενείς με μυοπάθειες νεμαλίνης, καταδείξαμε επίσης τη χρησιμότητα, την αποτελεσματικότητα και την εφαρμοσιμότητα της πρωτεωμικής μεμονωμένων μυοϊνών για την αποσαφήνιση της κλινικής παθοφυσιολογίας του σκελετικού μυός. Επιπλέον, συγκρίνοντας τη ροή εργασίας μας με την ολική πρωτεωμική ανάλυση, καταφέραμε να αποδείξουμε ότι η πρωτεωμική μεμονωμένων μυοϊνών παρέχει το ίδιο βάθος πληροφοριών με την ολική πρωτεωμική ιστών και επεκτείνει αυτό το βάθος λαμβάνοντας υπόψη την ετερογένεια μεταξύ των ινών και τον τύπο των μυοϊνών. Εκτός από τις αναμενόμενες (αν και μεταβλητές) διαφορές στην αναλογία τύπου ινών που παρατηρήθηκαν στις μυοπάθειες νεμαλίνης ACTA1 και TNNT1 σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες,19 παρατηρήσαμε επίσης οξειδωτική και εξωκυτταρική αναδιαμόρφωση ανεξάρτητα από την αλλαγή τύπου ινών που προκαλείται από MYH. Η ίνωση έχει αναφερθεί προηγουμένως σε μυοπάθειες TNNT1 nemaline.19 Ωστόσο, η ανάλυσή μας βασίζεται σε αυτό το εύρημα αποκαλύπτοντας επίσης αυξημένα επίπεδα εξωκυτταρικών εκκρινόμενων πρωτεϊνών που σχετίζονται με το στρες, όπως οι αννεξίνες, που εμπλέκονται σε μηχανισμούς επιδιόρθωσης του σαρκολεμφώματος, σε μυϊκές ίνες από ασθενείς με μυοπάθειες ACTA1 και TNNT1 nemaline.57,58,59 Συμπερασματικά, τα αυξημένα επίπεδα αννεξίνης σε μυϊκές ίνες από ασθενείς με μυοπάθεια nemaline μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια κυτταρική απόκριση για την επιδιόρθωση σοβαρά ατροφικών μυϊκών ινών.
Παρόλο που αυτή η μελέτη αντιπροσωπεύει τη μεγαλύτερη ανάλυση μονοϊνικής ίνας σε ανθρώπους μέχρι σήμερα, δεν είναι χωρίς περιορισμούς. Απομονώσαμε σκελετικές μυϊκές ίνες από ένα σχετικά μικρό και ομοιογενές δείγμα συμμετεχόντων και έναν μόνο μυ (τον έξω πλατύ μυ). Επομένως, είναι αδύνατο να αποκλειστεί η ύπαρξη συγκεκριμένων πληθυσμών ινών σε όλους τους τύπους μυών και σε ακραίες καταστάσεις της μυϊκής φυσιολογίας. Για παράδειγμα, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα εμφάνισης ενός υποσυνόλου εξαιρετικά γρήγορων ινών (π.χ. καθαρών ινών 2X) σε άρτια εκπαιδευμένους σπρίντερ ή/και αθλητές δύναμης79 ή κατά τη διάρκεια περιόδων μυϊκής αδράνειας66,80. Επιπλέον, το περιορισμένο μέγεθος δείγματος των συμμετεχόντων μας εμπόδισε να διερευνήσουμε τις διαφορές των φύλων στην ετερογένεια των ινών, καθώς οι αναλογίες τύπων ινών είναι γνωστό ότι διαφέρουν μεταξύ ανδρών και γυναικών. Επιπλέον, δεν μπορέσαμε να διεξάγουμε μεταγραφικές και πρωτεωμικές αναλύσεις στις ίδιες μυϊκές ίνες ή δείγματα από τους ίδιους συμμετέχοντες. Καθώς εμείς και άλλοι συνεχίζουμε να βελτιστοποιούμε τις αναλύσεις μεμονωμένων κυττάρων και μεμονωμένων μυϊκών ινών χρησιμοποιώντας ανάλυση ομικών για να επιτύχουμε εξαιρετικά χαμηλή εισαγωγή δείγματος (όπως αποδεικνύεται εδώ στην ανάλυση ινών από ασθενείς με μιτοχονδριακή μυοπάθεια), καθίσταται εμφανής η ευκαιρία να συνδυαστούν προσεγγίσεις πολλαπλών ομικών (και λειτουργικών) προσεγγίσεων εντός μεμονωμένων μυϊκών ινών.
Συνολικά, τα δεδομένα μας προσδιορίζουν και εξηγούν μεταγραφικούς και μετα-μεταγραφικούς παράγοντες που επηρεάζουν την ετερογένεια των σκελετικών μυών. Συγκεκριμένα, παρουσιάζουμε δεδομένα που αμφισβητούν ένα μακροχρόνιο δόγμα στη φυσιολογία των σκελετικών μυών που σχετίζεται με τον κλασικό ορισμό των τύπων ινών που βασίζεται στην MYH. Ελπίζουμε να ανανεώσουμε τη συζήτηση και τελικά να επανεξετάσουμε την κατανόησή μας για την ταξινόμηση και την ετερογένεια των σκελετικών μυϊκών ινών.
Δεκατέσσερις Καυκάσιοι συμμετέχοντες (12 άνδρες και 2 γυναίκες) συμφώνησαν οικειοθελώς να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Γάνδης (BC-10237), συμμορφώθηκε με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι του 2013 και καταχωρήθηκε στο ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Τα γενικά χαρακτηριστικά των συμμετεχόντων παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1. Μετά την απόκτηση προφορικής και γραπτής ενημερωμένης συγκατάθεσης, οι συμμετέχοντες υποβλήθηκαν σε ιατρική εξέταση πριν από την τελική ένταξή τους στη μελέτη. Οι συμμετέχοντες ήταν νέοι (22-42 ετών), υγιείς (χωρίς ιατρικές παθήσεις, χωρίς ιστορικό καπνίσματος) και μέτρια σωματικά δραστήριοι. Η μέγιστη πρόσληψη οξυγόνου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα βηματικό εργόμετρο για την αξιολόγηση της σωματικής ικανότητας, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 81
Δείγματα βιοψίας μυών συλλέχθηκαν σε κατάσταση ηρεμίας και νηστείας τρεις φορές, με διαφορά 14 ημερών. Επειδή αυτά τα δείγματα συλλέχθηκαν στο πλαίσιο μιας ευρύτερης μελέτης, οι συμμετέχοντες κατανάλωσαν εικονικό φάρμακο (λακτόζη), έναν ανταγωνιστή υποδοχέα H1 (540 mg φεξοφεναδίνης) ή έναν ανταγωνιστή υποδοχέα H2 (40 mg φαμοτιδίνης) 40 λεπτά πριν από τη βιοψία. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι αυτοί οι ανταγωνιστές υποδοχέων ισταμίνης δεν επηρεάζουν την ικανότητα ηρεμίας των σκελετικών μυών81 και δεν παρατηρήθηκε συσσωμάτωση σχετιζόμενη με την κατάσταση στα διαγράμματα ποιοτικού ελέγχου μας (Συμπληρωματικά Σχήματα 3 και 6). Μια τυποποιημένη δίαιτα (41,4 kcal/kg σωματικού βάρους, 5,1 g/kg σωματικού βάρους υδατάνθρακες, 1,4 g/kg σωματικού βάρους πρωτεΐνες και 1,6 g/kg σωματικού βάρους λίπος) διατηρήθηκε για 48 ώρες πριν από κάθε πειραματική ημέρα και ένα τυποποιημένο πρωινό (1,5 g/kg σωματικού βάρους υδατάνθρακες) καταναλώθηκε το πρωί της πειραματικής ημέρας. Υπό τοπική αναισθησία (0,5 ml λιδοκαΐνης 1% χωρίς επινεφρίνη), ελήφθησαν μυϊκές βιοψίες από τον έξω πλατύ μυ χρησιμοποιώντας διαδερμική αναρρόφηση Bergström.82 Τα δείγματα μυών ενσωματώθηκαν αμέσως σε RNAlater και αποθηκεύτηκαν στους 4°C μέχρι τη χειροκίνητη ανατομή των ινών (έως 3 ημέρες).
Οι φρεσκοαπομονωμένες δέσμες μυοϊνών μεταφέρθηκαν σε φρέσκο μέσο RNAlater σε τρυβλίο καλλιέργειας. Οι μεμονωμένες μυοϊνες στη συνέχεια ανατέμνονταν χειροκίνητα χρησιμοποιώντας στερεομικροσκόπιο και λεπτή τσιμπιδάκι. Είκοσι πέντε ίνες ανατέμνονταν από κάθε βιοψία, δίνοντας ιδιαίτερη προσοχή στην επιλογή ινών από διαφορετικές περιοχές της βιοψίας. Μετά την ανατομή, κάθε ίνα βυθίστηκε απαλά σε 3 μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) που περιείχε ένζυμα πρωτεϊνάσης Κ και DNase για την απομάκρυνση ανεπιθύμητων πρωτεϊνών και DNA. Η κυτταρική λύση και η αφαίρεση πρωτεΐνης/DNA ξεκίνησαν στη συνέχεια με σύντομη ανακίνηση σε στροβιλισμό, περιστροφή του υγρού σε μικροφυγόκεντρο και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου (10 λεπτά). Το λύμα στη συνέχεια επωάστηκε σε θερμικό κυκλοποιητή (T100, Bio-Rad) στους 37°C για 5 λεπτά, στους 75°C για 5 λεπτά και στη συνέχεια αποθηκεύτηκε αμέσως στους -80°C μέχρι περαιτέρω επεξεργασίας.
Βιβλιοθήκες πολυαδενυλιωμένου RNA συμβατές με Illumina παρασκευάστηκαν από 2 µl λύματος μυοϊνών χρησιμοποιώντας το κιτ προετοιμασίας βιβλιοθήκης QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq (Lexogen). Λεπτομερείς μέθοδοι βρίσκονται στο εγχειρίδιο του κατασκευαστή. Η διαδικασία ξεκινά με τη σύνθεση cDNA πρώτης αλυσίδας μέσω αντίστροφης μεταγραφής, κατά την οποία εισάγονται μοναδικοί μοριακοί αναγνωριστικοί κώδικες (UMI) και ειδικοί για το δείγμα γραμμωτοί κώδικες i1 για να διασφαλιστεί η συγκέντρωση δειγμάτων και να μειωθεί η τεχνική μεταβλητότητα κατά την επεξεργασία κατάντη. Το cDNA από 96 μυοϊνες στη συνέχεια συγκεντρώνεται και καθαρίζεται με μαγνητικά σφαιρίδια, μετά το οποίο αφαιρείται το RNA και πραγματοποιείται σύνθεση δεύτερης αλυσίδας χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές. Η βιβλιοθήκη καθαρίζεται με μαγνητικά σφαιρίδια, προστίθενται ετικέτες i5/i7 ειδικές για την ομάδα και ενισχύεται η PCR. Ένα τελικό βήμα καθαρισμού παράγει βιβλιοθήκες συμβατές με Illumina. Η ποιότητα κάθε ομάδας βιβλιοθήκης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ανάλυσης DNA μικρών θραυσμάτων υψηλής ευαισθησίας (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Με βάση την ποσοτικοποίηση Qubit, οι ομάδες ομαδοποιήθηκαν περαιτέρω σε ισομοριακές συγκεντρώσεις (2 nM). Η ομάδα που προέκυψε στη συνέχεια αλληλουχήθηκε σε ένα όργανο NovaSeq 6000 σε τυπική λειτουργία χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίων NovaSeq S2 (1 × 100 νουκλεοτίδια) με φορτίο 2 nM (4% PhiX).
Η δέσμη δεδομένων μας βασίζεται στη δέσμη ανάλυσης δεδομένων QuantSeq Pool της Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Τα δεδομένα αποπολυπλεξίστηκαν πρώτα με το bcl2fastq2 (v2.20.0) με βάση τον δείκτη i7/i5. Η ανάγνωση 2 αποπολυπλεξτηκε στη συνέχεια με το idemux (v0.1.6) με βάση τον γραμμωτό κώδικα του δείγματος i1 και οι αλληλουχίες UMI εξήχθησαν με το umi_tools (v1.0.1). Οι αναγνώσεις στη συνέχεια περικόπηκαν με το cutadapt (v3.4) σε πολλαπλούς γύρους για να αφαιρεθούν οι σύντομες αναγνώσεις (<20 σε μήκος) ή οι αναγνώσεις που αποτελούνται αποκλειστικά από αλληλουχίες προσαρμογέα. Οι αναγνώσεις στη συνέχεια ευθυγραμμίστηκαν με το ανθρώπινο γονιδίωμα χρησιμοποιώντας το STAR (v2.6.0c) και τα αρχεία BAM ευρετηριάστηκαν με το SAMtools (v1.11). Οι διπλότυπες αναγνώσεις αφαιρέθηκαν χρησιμοποιώντας το umi_tools (v1.0.1). Τέλος, η καταμέτρηση ευθυγράμμισης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το featureCounts στο Subread (v2.0.3). Ο ποιοτικός έλεγχος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το FastQC (v0.11.9) σε διάφορα ενδιάμεσα στάδια της διαδικασίας.
Όλη η περαιτέρω βιοπληροφορική επεξεργασία και οπτικοποίηση πραγματοποιήθηκαν σε R (v4.2.3), χρησιμοποιώντας κυρίως τη ροή εργασίας Seurat (v4.4.0). 83 Επομένως, μεμονωμένες τιμές UMI και πίνακες μεταδεδομένων μετασχηματίστηκαν σε αντικείμενα Seurat. Τα γονίδια που εκφράζονταν σε λιγότερο από 30% όλων των ινών αφαιρέθηκαν. Τα δείγματα χαμηλής ποιότητας αφαιρέθηκαν με βάση ένα ελάχιστο όριο 1000 τιμών UMI και 1000 ανιχνευμένων γονιδίων. Τελικά, 925 ίνες πέρασαν όλα τα βήματα φιλτραρίσματος ποιοτικού ελέγχου. Οι τιμές UMI ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Seurat SCTransform v2, 84 συμπεριλαμβανομένων και των 7418 ανιχνευμένων χαρακτηριστικών, και οι διαφορές μεταξύ των συμμετεχόντων εξαλείφθηκαν. Όλα τα σχετικά μεταδεδομένα βρίσκονται στο Συμπληρωματικό Σύνολο Δεδομένων 28.
Ώρα δημοσίευσης: 10 Σεπτεμβρίου 2025