Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για καλύτερα αποτελέσματα, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα νεότερο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα εμφανίσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Η καθιέρωση ζωικών μοντέλων τροποποιημένης αλλαγής (MC) είναι μια σημαντική βάση για τη μελέτη της MC. Πενήντα τέσσερα λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας χωρίστηκαν σε ομάδα εικονικής επέμβασης, ομάδα εμφύτευσης μυών (ομάδα ΜΕ) και ομάδα εμφύτευσης πολφικού πυρήνα (ομάδα NPE). Στην ομάδα NPE, ο μεσοσπονδύλιος δίσκος εκτέθηκε με προσθιοπλάγια οσφυϊκή χειρουργική προσέγγιση και χρησιμοποιήθηκε μια βελόνα για να τρυπήσει το σπονδυλικό σώμα L5 κοντά στην ακραία πλάκα. Το NP εξήχθη από τον μεσοσπονδύλιο δίσκο L1/2 με μια σύριγγα και εγχύθηκε σε αυτόν. Διάνοιξη οπής στο υποχόνδριο οστό. Οι χειρουργικές επεμβάσεις και οι μέθοδοι διάτρησης στην ομάδα εμφύτευσης μυών και στην ομάδα εικονικής επέμβασης ήταν οι ίδιες με εκείνες στην ομάδα εμφύτευσης NP. Στην ομάδα ME, ένα κομμάτι μυός τοποθετήθηκε στην τρύπα, ενώ στην ομάδα εικονικής επέμβασης, δεν τοποθετήθηκε τίποτα στην τρύπα. Μετά την επέμβαση πραγματοποιήθηκε μαγνητική τομογραφία και μοριακός βιολογικός έλεγχος. Το σήμα στην ομάδα NPE άλλαξε, αλλά δεν υπήρξε εμφανής αλλαγή σήματος στην ομάδα εικονικής λειτουργίας και στην ομάδα ME. Η ιστολογική παρατήρηση έδειξε ότι παρατηρήθηκε μη φυσιολογικός πολλαπλασιασμός ιστού στη θέση εμφύτευσης και η έκφραση των IL-4, IL-17 και IFN-γ ήταν αυξημένη στην ομάδα NPE. Η εμφύτευση NP στο υποχόνδριο οστό μπορεί να σχηματίσει ένα ζωικό μοντέλο MC.
Οι τροπικές αλλαγές (MC) είναι βλάβες των σπονδυλικών τελικών πλακών και του παρακείμενου μυελού των οστών ορατές στην απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI). Είναι αρκετά συχνές σε άτομα με συναφή συμπτώματα1. Πολλές μελέτες έχουν τονίσει τη σημασία της MC λόγω της συσχέτισής της με τον πόνο στη μέση (LBP)2,3. Οι de Roos et al.4 και Modic et al.5 ανεξαρτήτως περιέγραψαν αρχικά τρεις διαφορετικούς τύπους ανωμαλιών υποχόνδριου σήματος στον σπονδυλικό μυελό των οστών. Οι αλλαγές τύπου I είναι υποεντατικές σε αλληλουχίες με βαρύτητα T1 (T1W) και υπέρεντες σε αλληλουχίες με βαρύτητα T2 (T2W). Αυτή η βλάβη αποκαλύπτει ακραίες πλάκες ρωγμών και παρακείμενο αγγειακό κοκκιώδη ιστό στον μυελό των οστών. Οι αλλαγές Modic τύπου II δείχνουν υψηλό σήμα και στις ακολουθίες T1W και T2W. Σε αυτόν τον τύπο βλάβης, μπορεί να βρεθεί καταστροφή της τελικής πλάκας, καθώς και ιστολογική λιπώδης αντικατάσταση του παρακείμενου μυελού των οστών. Οι αλλαγές Modic τύπου III δείχνουν χαμηλό σήμα στις ακολουθίες T1W και T2W. Έχουν παρατηρηθεί σκληρωτικές βλάβες που αντιστοιχούν στις τελικές πλάκες6. Η MC θεωρείται παθολογική νόσος της σπονδυλικής στήλης και συνδέεται στενά με πολλές εκφυλιστικές παθήσεις της σπονδυλικής στήλης7,8,9.
Λαμβάνοντας υπόψη τα διαθέσιμα δεδομένα, αρκετές μελέτες έχουν παράσχει λεπτομερείς πληροφορίες για την αιτιολογία και τους παθολογικούς μηχανισμούς της MC. Albert et al. πρότεινε ότι η MC μπορεί να προκαλείται από κήλη δίσκου8. Οι Hu et al. απέδωσε το MC σε σοβαρή εκφύλιση του δίσκου10. Ο Kroc πρότεινε την έννοια της «εσωτερικής ρήξης δίσκου», η οποία δηλώνει ότι το επαναλαμβανόμενο τραύμα του δίσκου μπορεί να οδηγήσει σε μικροσχίγματα στην τελική πλάκα. Μετά το σχηματισμό σχισμής, η καταστροφή της τελικής πλάκας από τον πολφικό πυρήνα (NP) μπορεί να πυροδοτήσει μια αυτοάνοση απόκριση, η οποία οδηγεί περαιτέρω στην ανάπτυξη του MC11. Οι Ma et al. συμμερίστηκε παρόμοια άποψη και ανέφερε ότι η επαγόμενη από NP αυτοάνοση παίζει βασικό ρόλο στην παθογένεση του MC12.
Τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, ειδικά τα βοηθητικά λεμφοκύτταρα CD4+ Τ, παίζουν κρίσιμο ρόλο στην παθογένεση της αυτοανοσίας13. Το υποσύνολο Th17 που ανακαλύφθηκε πρόσφατα παράγει την προφλεγμονώδη κυτοκίνη IL-17, προάγει την έκφραση χημειοκίνης και διεγείρει τα Τ κύτταρα σε κατεστραμμένα όργανα να παράγουν IFN-γ14. Τα κύτταρα Th2 παίζουν επίσης μοναδικό ρόλο στην παθογένεση των ανοσολογικών αποκρίσεων. Η έκφραση της IL-4 ως αντιπροσωπευτικού κυττάρου Th2 μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρές ανοσοπαθολογικές συνέπειες15.
Αν και πολλές κλινικές μελέτες έχουν διεξαχθεί σε MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, εξακολουθεί να υπάρχει έλλειψη κατάλληλων πειραματικών μοντέλων σε ζώα που μπορούν να μιμηθούν τη διαδικασία MC που εμφανίζεται συχνά στους ανθρώπους και μπορεί να χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση της αιτιολογίας ή νέες θεραπείες όπως η στοχευμένη θεραπεία. Μέχρι σήμερα, μόνο μερικά ζωικά μοντέλα MC έχουν αναφερθεί για τη μελέτη των υποκείμενων παθολογικών μηχανισμών.
Με βάση την αυτοάνοση θεωρία που προτάθηκε από τους Albert και Ma, αυτή η μελέτη καθιέρωσε ένα απλό και αναπαραγώγιμο μοντέλο MC κουνελιού με αυτόματη μεταμόσχευση NP κοντά στην τρυπημένη σπονδυλική ακραία πλάκα. Άλλοι στόχοι είναι η παρατήρηση των ιστολογικών χαρακτηριστικών των ζωικών μοντέλων και η αξιολόγηση των ειδικών μηχανισμών της NP στην ανάπτυξη της MC. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιούμε τεχνικές όπως η μοριακή βιολογία, η μαγνητική τομογραφία και οι ιστολογικές μελέτες για τη μελέτη της εξέλιξης της MC.
Δύο κουνέλια πέθαναν από αιμορραγία κατά τη διάρκεια της επέμβασης και τέσσερα κουνέλια πέθαναν κατά τη διάρκεια της αναισθησίας κατά τη διάρκεια της μαγνητικής τομογραφίας. Τα υπόλοιπα 48 κουνέλια επέζησαν και δεν εμφάνισαν συμπτώματα συμπεριφοράς ή νευρολογικά συμπτώματα μετά την επέμβαση.
Η μαγνητική τομογραφία δείχνει ότι η ένταση του σήματος του ενσωματωμένου ιστού σε διαφορετικές οπές είναι διαφορετική. Η ένταση του σήματος του σπονδυλικού σώματος L5 στην ομάδα NPE άλλαξε σταδιακά στις 12, 16 και 20 εβδομάδες μετά την εισαγωγή (η αλληλουχία T1W έδειξε χαμηλό σήμα και η ακολουθία T2W έδειξε μικτό σήμα συν χαμηλό σήμα) (Εικ. 1C), ενώ οι εμφανίσεις της μαγνητικής τομογραφίας από τις άλλες δύο ομάδες ενσωματωμένων μερών παρέμειναν σχετικά σταθερές κατά την ίδια περίοδο (Εικ. 1Α, Β).
(Α) Αντιπροσωπευτικές διαδοχικές μαγνητικές τομογραφίες της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης του κουνελιού σε 3 χρονικά σημεία. Δεν βρέθηκαν ανωμαλίες σήματος στις εικόνες της ομάδας εικονικής επέμβασης. (Β) Τα χαρακτηριστικά σήματος του σπονδυλικού σώματος στην ομάδα ΜΕ είναι παρόμοια με εκείνα της ομάδας εικονικής επέμβασης και δεν παρατηρείται σημαντική αλλαγή σήματος στη θέση ενσωμάτωσης με την πάροδο του χρόνου. (Γ) Στην ομάδα NPE, το χαμηλό σήμα είναι σαφώς ορατό στην ακολουθία T1W και το μικτό σήμα και το χαμηλό σήμα είναι σαφώς ορατά στην ακολουθία T2W. Από την περίοδο των 12 εβδομάδων έως την περίοδο των 20 εβδομάδων, τα σποραδικά υψηλά σήματα που περιβάλλουν τα χαμηλά σήματα στην ακολουθία T2W μειώνονται.
Προφανής υπερπλασία των οστών μπορεί να φανεί στη θέση εμφύτευσης του σπονδυλικού σώματος στην ομάδα NPE και η υπερπλασία των οστών εμφανίζεται ταχύτερα από 12 έως 20 εβδομάδες (Εικ. 2C) σε σύγκριση με την ομάδα NPE, δεν παρατηρείται σημαντική αλλαγή στην μοντελοποιημένη σπονδυλική στήλη σώματα? Sham ομάδα και ME ομάδα (Εικ. 2C) 2A,B).
(Α) Η επιφάνεια του σπονδυλικού σώματος στο εμφυτευμένο τμήμα είναι πολύ λεία, η οπή επουλώνεται καλά και δεν υπάρχει υπερπλασία στο σπονδυλικό σώμα. (Β) Το σχήμα της εμφυτευμένης θέσης στην ομάδα ΜΕ είναι παρόμοιο με αυτό στην ομάδα εικονικής επέμβασης και δεν υπάρχει εμφανής αλλαγή στην εμφάνιση της εμφυτευμένης θέσης με την πάροδο του χρόνου. (Γ) Υπερπλασία οστών εμφανίστηκε στο σημείο της εμφύτευσης στην ομάδα NPE. Η υπερπλασία των οστών αυξήθηκε γρήγορα και επεκτάθηκε ακόμη και μέσω του μεσοσπονδύλιου δίσκου στο ετερόπλευρο σπονδυλικό σώμα.
Η ιστολογική ανάλυση παρέχει πιο λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τον σχηματισμό οστού. Το Σχήμα 3 δείχνει τις φωτογραφίες των μετεγχειρητικών τομών που χρωματίστηκαν με H&E. Στην ομάδα εικονικής επέμβασης, τα χονδροκύτταρα ήταν καλά διατεταγμένα και δεν ανιχνεύθηκε κυτταρικός πολλαπλασιασμός (Εικ. 3Α). Η κατάσταση στην ομάδα ΜΕ ήταν παρόμοια με εκείνη στην ομάδα εικονικής επέμβασης (Εικ. 3Β). Ωστόσο, στην ομάδα NPE, παρατηρήθηκε μεγάλος αριθμός χονδροκυττάρων και πολλαπλασιασμός κυττάρων που μοιάζουν με NP στη θέση εμφύτευσης (Εικ. 3C).
(Α) Οι δοκίδες μπορούν να φανούν κοντά στην ακραία πλάκα, τα χονδροκύτταρα είναι τακτοποιημένα διατεταγμένα με ομοιόμορφο μέγεθος και σχήμα κυττάρου και χωρίς πολλαπλασιασμό (40 φορές). (Β) Η κατάσταση της θέσης εμφύτευσης στην ομάδα ΜΕ είναι παρόμοια με αυτή της εικονικής ομάδας. Μπορούν να φανούν δοκίδες και χονδροκύτταρα, αλλά δεν υπάρχει εμφανής πολλαπλασιασμός στο σημείο της εμφύτευσης (40 φορές). (Β) Μπορεί να φανεί ότι τα χονδροκύτταρα και τα κύτταρα που μοιάζουν με NP πολλαπλασιάζονται σημαντικά και το σχήμα και το μέγεθος των χονδροκυττάρων είναι ανομοιόμορφα (40 φορές).
Η έκφραση του mRNA της ιντερλευκίνης 4 (IL-4), του mRNA της ιντερλευκίνης 17 (IL-17) και του mRNA της ιντερφερόνης γ (IFN-γ) παρατηρήθηκαν και στις δύο ομάδες NPE και ME. Όταν συγκρίθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων-στόχων, οι γονιδιακές εκφράσεις των IL-4, IL-17 και IFN-γ αυξήθηκαν σημαντικά στην ομάδα NPE σε σύγκριση με εκείνες της ομάδας ME και της ομάδας εικονικής επέμβασης (Εικ. 4). (Ρ < 0,05). Σε σύγκριση με την ομάδα εικονικής επέμβασης, τα επίπεδα έκφρασης της IL-4, IL-17 και IFN-γ στην ομάδα ΜΕ αυξήθηκαν ελαφρά μόνο και δεν έφτασαν σε στατιστική αλλαγή (P > 0,05).
Η έκφραση mRNA των IL-4, IL-17 και IFN-γ στην ομάδα NPE έδειξε σημαντικά υψηλότερη τάση από εκείνες στην ομάδα εικονικής επέμβασης και την ομάδα ΜΕ (P <0,05).
Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης στην ομάδα ΜΕ δεν παρουσίασαν σημαντική διαφορά (P>0,05).
Πραγματοποιήθηκε ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα έναντι IL-4 και IL-17 για να επιβεβαιωθεί το τροποποιημένο πρότυπο έκφρασης mRNA. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 5Α, Β, σε σύγκριση με την ομάδα ΜΕ και την ομάδα εικονικής επέμβασης, τα επίπεδα πρωτεΐνης της IL-4 και της IL-17 στην ομάδα NPE ήταν σημαντικά αυξημένα (Ρ < 0,05). Σε σύγκριση με την ομάδα εικονικής επέμβασης, τα επίπεδα πρωτεΐνης της IL-4 και της IL-17 στην ομάδα ΜΕ απέτυχαν επίσης να φτάσουν στατιστικά σημαντικές αλλαγές (P> 0,05).
(Α) Τα επίπεδα πρωτεΐνης της IL-4 και της IL-17 στην ομάδα NPE ήταν σημαντικά υψηλότερα από εκείνα στην ομάδα ΜΕ και την ομάδα εικονικού φαρμάκου (P <0,05). (Β) Ιστόγραμμα Western blot.
Λόγω του περιορισμένου αριθμού ανθρώπινων δειγμάτων που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης, οι σαφείς και λεπτομερείς μελέτες σχετικά με την παθογένεια της MC είναι κάπως δύσκολες. Επιχειρήσαμε να δημιουργήσουμε ένα ζωικό μοντέλο MC για να μελετήσουμε τους πιθανούς παθολογικούς μηχανισμούς του. Ταυτόχρονα, ακτινολογική αξιολόγηση, ιστολογική αξιολόγηση και μοριακή βιολογική αξιολόγηση χρησιμοποιήθηκαν για την παρακολούθηση της πορείας της MC που προκαλείται από αυτομόσχευμα NP. Ως αποτέλεσμα, το μοντέλο εμφύτευσης NP οδήγησε σε μια σταδιακή αλλαγή στην ένταση του σήματος από χρονικά σημεία 12 εβδομάδων σε 20 εβδομάδων (μικτό χαμηλό σήμα σε ακολουθίες T1W και χαμηλό σήμα σε αλληλουχίες T2W), υποδεικνύοντας αλλαγές στον ιστό και τις ιστολογικές και μοριακές βιολογικές αξιολογήσεις επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα της ακτινολογικής μελέτης.
Τα αποτελέσματα αυτού του πειράματος δείχνουν ότι εμφανίστηκαν οπτικές και ιστολογικές αλλαγές στο σημείο της προσβολής του σπονδυλικού σώματος στην ομάδα NPE. Ταυτόχρονα, παρατηρήθηκε η έκφραση των γονιδίων IL-4, IL-17 και IFN-γ, καθώς και IL-4, IL-17 και IFN-γ, υποδεικνύοντας ότι η παραβίαση του αυτόλογου πολφικού ιστού του πυρήνα στον σπονδυλικό σώμα μπορεί να προκαλέσει μια σειρά σημάτων και μορφολογικών αλλαγών. Είναι εύκολο να διαπιστωθεί ότι τα χαρακτηριστικά σήματος των σπονδυλικών σωμάτων του ζωικού μοντέλου (χαμηλό σήμα στην ακολουθία T1W, μικτό σήμα και χαμηλό σήμα στην ακολουθία T2W) είναι πολύ παρόμοια με εκείνα των ανθρώπινων σπονδυλικών κυττάρων και τα χαρακτηριστικά MRI επίσης επιβεβαιώνουν τις παρατηρήσεις της ιστολογίας και της χονδρικής ανατομίας, δηλαδή οι αλλαγές στα κύτταρα του σπονδυλικού σώματος είναι προοδευτικές. Αν και η φλεγμονώδης απόκριση που προκαλείται από οξύ τραύμα μπορεί να εμφανιστεί αμέσως μετά την παρακέντηση, τα αποτελέσματα της μαγνητικής τομογραφίας έδειξαν ότι προοδευτικά αυξανόμενες αλλαγές σήματος εμφανίστηκαν 12 εβδομάδες μετά την παρακέντηση και παρέμειναν έως και 20 εβδομάδες χωρίς σημάδια ανάκτησης ή αναστροφής των αλλαγών της μαγνητικής τομογραφίας. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αυτόλογη σπονδυλική NP είναι μια αξιόπιστη μέθοδος για την καθιέρωση προοδευτικής MV σε κουνέλια.
Αυτό το μοντέλο παρακέντησης απαιτεί επαρκή ικανότητα, χρόνο και χειρουργική προσπάθεια. Σε προκαταρκτικά πειράματα, η ανατομή ή η υπερβολική διέγερση των παρασπονδυλικών συνδέσμων μπορεί να οδηγήσει στο σχηματισμό σπονδυλικών οστεοφύτων. Θα πρέπει να δίνεται προσοχή ώστε να μην προκληθούν ζημιές ή ερεθισμοί στους διπλανούς δίσκους. Δεδομένου ότι το βάθος διείσδυσης πρέπει να ελέγχεται για να επιτευχθούν σταθερά και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα, φτιάξαμε χειροκίνητα ένα βύσμα κόβοντας το περίβλημα μιας βελόνας μήκους 3 mm. Η χρήση αυτού του βύσματος εξασφαλίζει ομοιόμορφο βάθος διάτρησης στο σπονδυλικό σώμα. Σε προκαταρκτικά πειράματα, τρεις ορθοπεδικοί χειρουργοί που συμμετείχαν στην επέμβαση βρήκαν ότι οι βελόνες 16 διαμετρήματος είναι πιο εύκολο να εργαστούν με βελόνες 18 διαμετρήματος ή άλλες μεθόδους. Για να αποφευχθεί η υπερβολική αιμορραγία κατά τη διάρκεια της διάτρησης, κρατώντας τη βελόνα ακίνητη για λίγο θα παρέχει μια πιο κατάλληλη οπή εισαγωγής, υποδηλώνοντας ότι ένας ορισμένος βαθμός MC μπορεί να ελεγχθεί με αυτόν τον τρόπο.
Αν και πολλές μελέτες έχουν στοχεύσει την MC, λίγα είναι γνωστά για την αιτιολογία και την παθογένεση της MC25,26,27. Με βάση τις προηγούμενες μελέτες μας, διαπιστώσαμε ότι η αυτοανοσία παίζει βασικό ρόλο στην εμφάνιση και την ανάπτυξη του MC12. Αυτή η μελέτη εξέτασε την ποσοτική έκφραση των IL-4, IL-17 και IFN-γ, που είναι οι κύριες οδοί διαφοροποίησης των κυττάρων CD4+ μετά από διέγερση με αντιγόνο. Στη μελέτη μας, σε σύγκριση με την αρνητική ομάδα, η ομάδα NPE είχε υψηλότερη έκφραση IL-4, IL-17 και IFN-γ και τα επίπεδα πρωτεΐνης της IL-4 και IL-17 ήταν επίσης υψηλότερα.
Κλινικά, η έκφραση του mRNA της IL-17 αυξάνεται σε κύτταρα NP από ασθενείς με κήλη δίσκου28. Αυξημένα επίπεδα έκφρασης IL-4 και IFN-γ βρέθηκαν επίσης σε ένα μοντέλο οξείας μη συμπιεστικής κήλης δίσκου σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες29. Η IL-17 παίζει βασικό ρόλο στη φλεγμονή, τον τραυματισμό ιστού σε αυτοάνοσα νοσήματα30 και ενισχύει την ανοσολογική απόκριση στην IFN-γ31. Ενισχυμένη βλάβη ιστού με τη μεσολάβηση της IL-17 έχει αναφερθεί σε ποντίκια MRL/lpr32 και σε ποντίκια ευαίσθητα σε αυτοάνοση33. Η IL-4 μπορεί να αναστείλει την έκφραση προφλεγμονωδών κυτοκινών (όπως η IL-1β και TNFα) και την ενεργοποίηση των μακροφάγων34. Αναφέρθηκε ότι η έκφραση mRNA της IL-4 ήταν διαφορετική στην ομάδα NPE σε σύγκριση με την IL-17 και την IFN-γ στο ίδιο χρονικό σημείο. Η έκφραση mRNA της IFN-γ στην ομάδα NPE ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτή στις άλλες ομάδες. Επομένως, η παραγωγή ΙΡΝ-γ μπορεί να είναι ένας μεσολαβητής της φλεγμονώδους απόκρισης που προκαλείται από την παρεμβολή ΝΡ. Μελέτες έχουν δείξει ότι η IFN-γ παράγεται από πολλαπλούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ενεργοποιημένων βοηθητικών Τ κυττάρων τύπου 1, των φυσικών φονικών κυττάρων και των μακροφάγων35,36 και είναι μια βασική προφλεγμονώδης κυτοκίνη που προάγει τις ανοσολογικές αποκρίσεις37.
Αυτή η μελέτη υποδηλώνει ότι η αυτοάνοση απόκριση μπορεί να εμπλέκεται στην εμφάνιση και την ανάπτυξη της MC. Οι Luoma et al. διαπιστώθηκε ότι τα χαρακτηριστικά σήματος του MC και του προεξέχοντος NP είναι παρόμοια στη μαγνητική τομογραφία και και τα δύο δείχνουν υψηλό σήμα στην ακολουθία T2W38. Ορισμένες κυτοκίνες έχει επιβεβαιωθεί ότι συνδέονται στενά με την εμφάνιση MC, όπως η IL-139. Οι Ma et al. πρότεινε ότι η προς τα πάνω ή προς τα κάτω προεξοχή του NP μπορεί να έχει μεγάλη επίδραση στην εμφάνιση και ανάπτυξη του MC12. Οι Bobechko40 και Herzbein et al.41 ανέφεραν ότι το NP είναι ένας ανοσοανεκτικός ιστός που δεν μπορεί να εισέλθει στην αγγειακή κυκλοφορία από τη γέννηση. Οι προεξοχές NP εισάγουν ξένα σώματα στην παροχή αίματος, μεσολαβώντας έτσι τοπικές αυτοάνοσες αντιδράσεις42. Οι αυτοάνοσες αντιδράσεις μπορούν να προκαλέσουν μεγάλο αριθμό ανοσολογικών παραγόντων και όταν αυτοί οι παράγοντες εκτίθενται συνεχώς στους ιστούς, μπορούν να προκαλέσουν αλλαγές στη σηματοδότηση43. Σε αυτή τη μελέτη, η υπερέκφραση των IL-4, IL-17 και IFN-γ είναι τυπικοί ανοσολογικοί παράγοντες, αποδεικνύοντας περαιτέρω τη στενή σχέση μεταξύ NP και MCs44. Αυτό το ζωικό μοντέλο μιμείται καλά την ανακάλυψη NP και την είσοδο στην τελική πλάκα. Αυτή η διαδικασία αποκάλυψε περαιτέρω την επίδραση της αυτοανοσίας στην MC.
Όπως ήταν αναμενόμενο, αυτό το ζωικό μοντέλο μας παρέχει μια πιθανή πλατφόρμα για να μελετήσουμε το MC. Ωστόσο, αυτό το μοντέλο εξακολουθεί να έχει ορισμένους περιορισμούς: πρώτον, κατά τη φάση της παρατήρησης των ζώων, ορισμένα κουνέλια ενδιάμεσου σταδίου πρέπει να υποβληθούν σε ευθανασία για ιστολογικές και μοριακές δοκιμές, έτσι ορισμένα ζώα «πέφτουν εκτός χρήσης» με την πάροδο του χρόνου. Δεύτερον, αν και ορίζονται τρία χρονικά σημεία σε αυτή τη μελέτη, δυστυχώς, μοντελοποιήσαμε μόνο έναν τύπο MC (αλλαγή Modic τύπου I), επομένως δεν αρκεί για να αναπαραστήσει τη διαδικασία ανάπτυξης της ανθρώπινης νόσου και πρέπει να οριστούν περισσότερα χρονικά σημεία σε Παρατηρήστε καλύτερα όλες τις αλλαγές σήματος. Τρίτον, οι αλλαγές στη δομή του ιστού μπορούν πράγματι να φανούν καθαρά με ιστολογική χρώση, αλλά ορισμένες εξειδικευμένες τεχνικές μπορούν να αποκαλύψουν καλύτερα τις μικροδομικές αλλαγές σε αυτό το μοντέλο. Για παράδειγμα, χρησιμοποιήθηκε μικροσκόπιο πολωμένου φωτός για την ανάλυση του σχηματισμού ινοχόνδρου σε μεσοσπονδύλιους δίσκους κουνελιού45. Οι μακροπρόθεσμες επιδράσεις του NP στο MC και στην τελική πλάκα απαιτούν περαιτέρω μελέτη.
Πενήντα τέσσερα αρσενικά λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας (βάρος περίπου 2,5-3 kg, ηλικία 3-3,5 μηνών) χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδα εικονικής επέμβασης, ομάδα εμφύτευσης μυών (ομάδα ΜΕ) και ομάδα εμφύτευσης νευρικής ρίζας (ομάδα NPE). Όλες οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Νοσοκομείου Tianjin και οι πειραματικές μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν αυστηρά σύμφωνα με τις εγκεκριμένες οδηγίες.
Έχουν γίνει κάποιες βελτιώσεις στη χειρουργική τεχνική του S. Sobajima 46 . Κάθε κουνέλι τοποθετήθηκε σε πλάγια ανάκλιση και η πρόσθια επιφάνεια πέντε διαδοχικών οσφυϊκών μεσοσπονδύλιων δίσκων (IVDs) εκτέθηκε χρησιμοποιώντας οπισθοπλάγια οπισθοπεριτοναϊκή προσέγγιση. Σε κάθε κουνέλι χορηγήθηκε γενική αναισθησία (20% ουρεθάνη, 5 ml/kg μέσω της φλέβας του αυτιού). Έγινε μια διαμήκης τομή του δέρματος από το κάτω άκρο των πλευρών μέχρι το χείλος της πυέλου, 2 cm κοιλιακά προς τους παρασπονδυλικούς μύες. Η δεξιά προσθιοπλάγια σπονδυλική στήλη από το L1 έως το L6 εκτέθηκε με απότομη και αμβλεία ανατομή του υπερκείμενου υποδόριου ιστού, του οπισθοπεριτοναϊκού ιστού και των μυών (Εικ. 6Α). Το επίπεδο του δίσκου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το χείλος της λεκάνης ως ανατομικό ορόσημο για το επίπεδο δίσκου L5-L6. Χρησιμοποιήστε μια βελόνα διάτρησης 16 διαμετρημάτων για να ανοίξετε μια τρύπα κοντά στην ακραία πλάκα του σπονδύλου L5 σε βάθος 3 mm (Εικ. 6Β). Χρησιμοποιήστε μια σύριγγα 5 ml για να αναρροφήσετε τον αυτόλογο πολφικό πυρήνα στον μεσοσπονδύλιο δίσκο L1-L2 (Εικ. 6C). Αφαιρέστε τον πολφικό πυρήνα ή τον μυ σύμφωνα με τις απαιτήσεις κάθε ομάδας. Μετά την εμβάθυνση της οπής, τοποθετούνται απορροφήσιμα ράμματα στη βαθιά περιτονία, την επιφανειακή περιτονία και το δέρμα, προσέχοντας να μην βλάψει τον περιοστικό ιστό του σπονδυλικού σώματος κατά τη διάρκεια της επέμβασης.
(Α) Ο δίσκος L5–L6 εκτίθεται μέσω οπισθοπλάγιας οπισθοπεριτοναϊκής προσέγγισης. (Β) Χρησιμοποιήστε μια βελόνα 16-gauge για να ανοίξετε μια τρύπα κοντά στην τελική πλάκα L5. (Γ) Συλλέγονται αυτόλογα MF.
Χορηγήθηκε γενική αναισθησία με 20% ουρεθάνη (5 ml/kg) που χορηγήθηκε μέσω της φλέβας του αυτιού και οι ακτινογραφίες οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης επαναλήφθηκαν στις 12, 16 και 20 εβδομάδες μετεγχειρητικά.
Τα κουνέλια θυσιάστηκαν με ενδομυϊκή ένεση κεταμίνης (25,0 mg/kg) και ενδοφλέβια πεντοβαρβιτάλη νατρίου (1,2 g/kg) στις 12, 16 και 20 εβδομάδες μετά την επέμβαση. Ολόκληρη η σπονδυλική στήλη αφαιρέθηκε για ιστολογική ανάλυση και έγινε πραγματική ανάλυση. Ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή (RT-qPCR) και Western blotting χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση αλλαγών στους ανοσολογικούς παράγοντες.
Οι εξετάσεις μαγνητικής τομογραφίας πραγματοποιήθηκαν σε κουνέλια χρησιμοποιώντας έναν κλινικό μαγνήτη 3,0 Τ (GE Medical Systems, Florence, SC) εξοπλισμένο με έναν ορθογώνιο δέκτη πηνίου άκρου. Τα κουνέλια αναισθητοποιήθηκαν με 20% ουρεθάνη (5 mL/kg) μέσω της φλέβας του αυτιού και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ύπτια θέση εντός του μαγνήτη με την οσφυϊκή περιοχή να επικεντρώνεται σε ένα πηνίο κυκλικής επιφάνειας διαμέτρου 5 ιντσών (GE Medical Systems). Λήφθηκαν εικόνες εντοπισμού στεφανιαίας στάθμης T2 (TR, 1445 ms, TE, 37 ms) για να καθοριστεί η θέση του οσφυϊκού δίσκου από L3–L4 έως L5–L6. Το οβελιαίο επίπεδο T2 ζυγισμένες φέτες αποκτήθηκαν με τις ακόλουθες ρυθμίσεις: γρήγορη ακολουθία spin-echo με χρόνο επανάληψης (TR) 2200 ms και χρόνο ηχούς (TE) 70 ms, μήτρα. οπτικό πεδίο 260 και οκτώ ερεθίσματα. Το πάχος κοπής ήταν 2 mm, το διάκενο ήταν 0,2 mm.
Μετά τη λήψη της τελευταίας φωτογραφίας και τη θανάτωση του τελευταίου κουνελιού, αφαιρέθηκαν οι ψεύτικοι δίσκοι, οι ενσωματωμένοι σε μυς και οι δίσκοι NP για ιστολογική εξέταση. Οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη 10% ουδέτερης ρύθμισης για 1 εβδομάδα, απασβεστοποιήθηκαν με αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ και τεμαχίστηκαν σε παραφίνη. Τα μπλοκ ιστού ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και κόπηκαν σε οβελιαία τμήματα (πάχους 5 μm) χρησιμοποιώντας μικροτόμο. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η&Ε).
Μετά τη συλλογή των μεσοσπονδύλιων δίσκων από τα κουνέλια σε κάθε ομάδα, το συνολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας στήλη UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ένα σύστημα αντίστροφης μεταγραφής ImProm II (Promega Inc. , Madison, WI, ΗΠΑ). Πραγματοποιήθηκε αντίστροφη μεταγραφή.
Η RT-qPCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) και SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο όγκος της αντίδρασης PCR ήταν 20 μl και περιείχε 1,5 μl αραιωμένου cDNA και 0,2 μΜ από κάθε εκκινητή. Τα Primers σχεδιάστηκαν από την OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) και κατασκευάστηκαν από την Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Κίνα) (Πίνακας 1). Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες συνθήκες θερμικού κύκλου: αρχικό στάδιο ενεργοποίησης πολυμεράσης στους 94°C για 2 λεπτά, στη συνέχεια 40 κύκλοι των 15 δευτερολέπτων ο καθένας στους 94°C για μετουσίωση του προτύπου, ανόπτηση για 1 λεπτό στους 60°C, επέκταση και φθορισμός. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν για 1 λεπτό στους 72°C. Όλα τα δείγματα ενισχύθηκαν τρεις φορές και η μέση τιμή χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση RT-qPCR. Τα δεδομένα ενίσχυσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Η έκφραση του γονιδίου IL-4, IL-17 και IFN-γ κανονικοποιήθηκε στον ενδογενή έλεγχο (ACTB). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA στόχου υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCT.
Η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από τους ιστούς χρησιμοποιώντας έναν ομογενοποιητή ιστού σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA (που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και φωσφατάσης) και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 13.000 rpm για 20 λεπτά στους 4°C για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα ιστού. Πενήντα μικρογραμμάρια πρωτεΐνης φορτώθηκαν ανά λωρίδα, διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Ο αποκλεισμός πραγματοποιήθηκε σε ξηρό γάλα 5% χωρίς λιπαρά σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με Tris (TBS) που περιείχε 0,1% Tween 20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτεύον αντίσωμα αντι-ντεκορίνης κουνελιού (αραιωμένο 1:200· Boster, Wuhan, Κίνα) (αραιωμένο 1:200· Bioss, Πεκίνο, Κίνα) όλη τη νύχτα στους 4°C και αντέδρασε τις δεύτερες ημέρες. με δευτερογενές αντίσωμα (ανοσοσφαιρίνη G κατσίκας κατά κουνελιού σε αραίωση 1:40.000) σε συνδυασμό με υπεροξειδάση χρένου (Boster, Wuhan, Κίνα) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα σήματα Western blot ανιχνεύθηκαν με αυξημένη χημειοφωταύγεια στη μεμβράνη χημειοφωταύγειας μετά από ακτινοβολία ακτίνων Χ. Για την πυκνομετρική ανάλυση, τα στυπώματα σαρώθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό BandScan και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο λόγος της ανοσοαντιδραστικότητας του γονιδίου στόχου προς την ανοσοαντιδραστικότητα τουμπουλίνης.
Οι στατιστικοί υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού SPSS16.0 (SPSS, ΗΠΑ). Τα δεδομένα που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της μελέτης εκφράστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση (μέση τιμή ± SD) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης επαναλαμβανόμενων μετρήσεων (ANOVA) για τον προσδιορισμό των διαφορών μεταξύ των δύο ομάδων. P < 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντικό.
Έτσι, η καθιέρωση ενός ζωικού μοντέλου MC με την εμφύτευση αυτόλογων NP στο σπονδυλικό σώμα και την εκτέλεση μακροανατομικής παρατήρησης, ανάλυση MRI, ιστολογική αξιολόγηση και μοριακή βιολογική ανάλυση μπορεί να γίνει ένα σημαντικό εργαλείο για την αξιολόγηση και την κατανόηση των μηχανισμών της ανθρώπινης MC και την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παρεμβάσεις.
Πώς να αναφέρετε αυτό το άρθρο: Han, C. et al. Ένα ζωικό μοντέλο αλλαγών Modic καθιερώθηκε με την εμφύτευση αυτόλογου πολφικού πυρήνα στο υποχόνδριο οστό της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., and Boos, N. Μαγνητική τομογραφία της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης: επιπολασμός δισκοκήλης και κατακράτησης, συμπίεση νευρικών ριζών, ανωμαλίες της τελικής πλάκας και οστεοαρθρίτιδα πλευρικής άρθρωσης σε ασυμπτωματικούς εθελοντές . τιμή. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, and Leboeuf-Eed, K. Modic αλλαγές και η σχέση τους με τα κλινικά ευρήματα. European Spine Journal: επίσημη δημοσίευση της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Σπονδυλικής Στήλης, της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Σπονδυλικής Παραμόρφωσης και της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Έρευνας Αυχενικής Σπονδυλικής Στήλης 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, Μ., et αϊ. Τροπικές αλλαγές στις οσφυϊκές σπονδυλικές τελικές πλάκες: επικράτηση και συσχέτιση με οσφυαλγία και ισχιαλγία σε μεσήλικες άνδρες εργαζόμενους. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, Α., Kressel, Η., Spritzer, Κ., and Dalinka, M. MRI των αλλαγών μυελού των οστών κοντά στην τελική πλάκα σε εκφυλιστική νόσο της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ και Carter, JR Εκφυλιστική νόσος του δίσκου: αξιολόγηση των αλλαγών του σπονδυλικού μυελού με μαγνητική τομογραφία. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS και Carter, JR Απεικόνιση εκφυλιστικής δισκοπάθειας. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et αϊ. Οι προγνωστικοί παράγοντες της νεοσπονδυλικής τελικής πλάκας (Modic) σηματοδοτούν αλλαγές στο γενικό πληθυσμό. European Spine Journal: Επίσημη δημοσίευση της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Σπονδυλικής Στήλης, της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Σπονδυλικής Παραμόρφωσης και της Ευρωπαϊκής Εταιρείας για την Έρευνα Αυχενικής Σπονδυλικής Στήλης, Τμήμα 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (201).
Αλλαγές Albert, HB και Mannisch, K. Modic μετά από κήλη οσφυϊκού δίσκου. European Spine Journal : Επίσημη δημοσίευση της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Σπονδυλικής Στήλης, της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Σπονδυλικής Παραμόρφωσης και της Ευρωπαϊκής Εταιρείας για την Έρευνα Αυχενικής Σπονδυλικής Στήλης 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., and Kaapa, E. Modic τύπου Ι αλλαγές μπορούν να προβλέψουν ταχέως προοδευτικό παραμορφωτικό εκφυλισμό δίσκου: μια προοπτική μελέτη 1 έτους. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ και Fan, SW Modic Αλλαγές: πιθανές αιτίες και συμβολή στον εκφυλισμό του οσφυϊκού δίσκου. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Εσωτερική ρήξη δίσκου. Προβλήματα πρόπτωσης δίσκου πάνω από 50 χρόνια. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Ώρα δημοσίευσης: Δεκ-13-2024