Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για καλύτερα αποτελέσματα, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα νεότερο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Η καθιέρωση ζωικών μοντέλων τροπικής αλλαγής (MC) αποτελεί σημαντική βάση για τη μελέτη του MC. Πενήντα τέσσερα λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας χωρίστηκαν σε ομάδα εικονικής επέμβασης, ομάδα εμφύτευσης μυός (ομάδα ME) και ομάδα εμφύτευσης πηκτοειδούς πυρήνα (ομάδα NPE). Στην ομάδα NPE, ο μεσοσπονδύλιος δίσκος αποκαλύφθηκε με πρόσθια πλάγια οσφυϊκή χειρουργική προσέγγιση και χρησιμοποιήθηκε βελόνα για την παρακέντηση του σπονδυλικού σώματος L5 κοντά στην τελική πλάκα. Ο NP εξήχθη από τον μεσοσπονδύλιο δίσκο L1/2 με σύριγγα και εγχύθηκε σε αυτόν. Διάτρηση οπής στο υποχόνδριο οστό. Οι χειρουργικές επεμβάσεις και οι μέθοδοι διάτρησης στην ομάδα εμφύτευσης μυός και στην ομάδα εικονικής επέμβασης ήταν οι ίδιες με αυτές στην ομάδα εμφύτευσης NP. Στην ομάδα ME, ένα κομμάτι μυός τοποθετήθηκε στην οπή, ενώ στην ομάδα εικονικής επέμβασης, δεν τοποθετήθηκε τίποτα στην οπή. Μετά την επέμβαση, πραγματοποιήθηκε μαγνητική τομογραφία και μοριακές βιολογικές εξετάσεις. Το σήμα στην ομάδα NPE άλλαξε, αλλά δεν υπήρξε εμφανής αλλαγή σήματος στην ομάδα εικονικής επέμβασης και στην ομάδα ME. Η ιστολογική παρατήρηση έδειξε ότι παρατηρήθηκε ανώμαλος πολλαπλασιασμός ιστών στο σημείο εμφύτευσης και η έκφραση των IL-4, IL-17 και IFN-γ ήταν αυξημένη στην ομάδα NPE. Η εμφύτευση NP στο υποχόνδριο οστό μπορεί να σχηματίσει ένα ζωικό μοντέλο MC.
Οι αλλαγές Modic (MC) είναι βλάβες των σπονδυλικών τελικών πλακών και του παρακείμενου μυελού των οστών, ορατές στη μαγνητική τομογραφία (MRI). Είναι αρκετά συχνές σε άτομα με σχετικά συμπτώματα1. Πολλές μελέτες έχουν τονίσει τη σημασία του MC λόγω της συσχέτισής του με τον πόνο στη μέση (LBP)2,3. Οι de Roos et al.4 και Modic et al.5 περιέγραψαν ανεξάρτητα πρώτοι τρεις διαφορετικούς τύπους υποχόνδριων ανωμαλιών σήματος στον σπονδυλικό μυελό των οστών. Οι αλλαγές Modic τύπου Ι είναι υποέντονες στις ακολουθίες T1-σταθμισμένες (T1W) και υπερέντονες στις ακολουθίες T2-σταθμισμένες (T2W). Αυτή η βλάβη αποκαλύπτει τελικές πλάκες σχισμών και παρακείμενο αγγειακό κοκκιώδη ιστό στον μυελό των οστών. Οι αλλαγές Modic τύπου II παρουσιάζουν υψηλό σήμα τόσο στις ακολουθίες T1W όσο και στις T2W. Σε αυτόν τον τύπο βλάβης, μπορεί να βρεθεί καταστροφή των τελικών πλακών, καθώς και ιστολογική λιπώδης αντικατάσταση του παρακείμενου μυελού των οστών. Οι αλλαγές Modic τύπου III παρουσιάζουν χαμηλό σήμα στις ακολουθίες T1W και T2W. Έχουν παρατηρηθεί σκληρωτικές βλάβες που αντιστοιχούν στις τελικές πλάκες6. Η σπονδυλική στήλη με κάκωση (MC) θεωρείται παθολογική νόσος της σπονδυλικής στήλης και σχετίζεται στενά με πολλές εκφυλιστικές παθήσεις της σπονδυλικής στήλης7,8,9.
Λαμβάνοντας υπόψη τα διαθέσιμα δεδομένα, αρκετές μελέτες έχουν παράσχει λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με την αιτιολογία και τους παθολογικούς μηχανισμούς του MC. Οι Albert et al. υπέδειξαν ότι το MC μπορεί να προκαλείται από κήλη δίσκου8. Οι Hu et al. απέδωσαν το MC σε σοβαρή εκφύλιση δίσκου10. Ο Kroc πρότεινε την έννοια της «εσωτερικής ρήξης δίσκου», η οποία δηλώνει ότι το επαναλαμβανόμενο τραύμα του δίσκου μπορεί να οδηγήσει σε μικρορήξεις στην τελική πλάκα. Μετά τον σχηματισμό της σχισμής, η καταστροφή της τελικής πλάκας από τον πηκτοειδή πυρήνα (NP) μπορεί να πυροδοτήσει μια αυτοάνοση απόκριση, η οποία οδηγεί περαιτέρω στην ανάπτυξη του MC11. Οι Ma et al. συμμερίστηκαν μια παρόμοια άποψη και ανέφεραν ότι η αυτοανοσία που προκαλείται από NP παίζει βασικό ρόλο στην παθογένεση του MC12.
Τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, ιδιαίτερα τα CD4+ βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα, παίζουν κρίσιμο ρόλο στην παθογένεση της αυτοανοσίας13. Το πρόσφατα ανακαλυφθέν υποσύνολο Th17 παράγει την προφλεγμονώδη κυτοκίνη IL-17, προάγει την έκφραση χημειοκίνης και διεγείρει τα Τ κύτταρα σε κατεστραμμένα όργανα να παράγουν IFN-γ14. Τα κύτταρα Th2 παίζουν επίσης έναν μοναδικό ρόλο στην παθογένεση των ανοσολογικών αποκρίσεων. Η έκφραση της IL-4 ως αντιπροσωπευτικού κυττάρου Th2 μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρές ανοσοπαθολογικές συνέπειες15.
Παρόλο που έχουν διεξαχθεί πολλές κλινικές μελέτες για την MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, εξακολουθεί να υπάρχει έλλειψη κατάλληλων πειραματικών μοντέλων σε ζώα που μπορούν να μιμηθούν τη διαδικασία MC που εμφανίζεται συχνά στους ανθρώπους και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διερεύνηση της αιτιολογίας ή νέων θεραπειών όπως η στοχευμένη θεραπεία. Μέχρι σήμερα, έχουν αναφερθεί μόνο λίγα ζωικά μοντέλα MC για τη μελέτη των υποκείμενων παθολογικών μηχανισμών.
Με βάση την αυτοάνοση θεωρία που προτάθηκε από τους Albert και Ma, αυτή η μελέτη δημιούργησε ένα απλό και αναπαραγώγιμο μοντέλο MC κουνελιού μέσω αυτομεταμόσχευσης νανοσωματιδίων κοντά στην τρυπημένη τελική πλάκα του σπονδύλου. Άλλοι στόχοι είναι η παρατήρηση των ιστολογικών χαρακτηριστικών των ζωικών μοντέλων και η αξιολόγηση των συγκεκριμένων μηχανισμών των νανοσωματιδίων στην ανάπτυξη του MC. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιούμε τεχνικές όπως η μοριακή βιολογία, η μαγνητική τομογραφία και οι ιστολογικές μελέτες για να μελετήσουμε την εξέλιξη του MC.
Δύο κουνέλια πέθαναν από αιμορραγία κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης και τέσσερα κουνέλια πέθαναν κατά τη διάρκεια της αναισθησίας κατά τη διάρκεια της μαγνητικής τομογραφίας. Τα υπόλοιπα 48 κουνέλια επέζησαν και δεν εμφάνισαν συμπεριφορικά ή νευρολογικά σημάδια μετά την επέμβαση.
Η μαγνητική τομογραφία δείχνει ότι η ένταση του σήματος του ενσωματωμένου ιστού σε διαφορετικές οπές είναι διαφορετική. Η ένταση του σήματος του σπονδυλικού σώματος L5 στην ομάδα NPE άλλαξε σταδιακά στις 12, 16 και 20 εβδομάδες μετά την εισαγωγή (η αλληλουχία T1W έδειξε χαμηλό σήμα και η αλληλουχία T2W έδειξε μικτό σήμα συν χαμηλό σήμα) (Εικ. 1C), ενώ οι εμφανίσεις στην μαγνητική τομογραφία των άλλων δύο ομάδων ενσωματωμένων τμημάτων παρέμειναν σχετικά σταθερές κατά την ίδια περίοδο (Εικ. 1A, B).
(Α) Αντιπροσωπευτικές διαδοχικές μαγνητικές τομογραφίες της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης κουνελιού σε 3 χρονικά σημεία. Δεν βρέθηκαν ανωμαλίες στο σήμα στις εικόνες της ομάδας εικονικής επέμβασης. (Β) Τα χαρακτηριστικά σήματος του σπονδυλικού σώματος στην ομάδα εικονικής επέμβασης είναι παρόμοια με αυτά της ομάδας εικονικής επέμβασης και δεν παρατηρείται σημαντική αλλαγή στο σήμα στο σημείο ενσωμάτωσης με την πάροδο του χρόνου. (Γ) Στην ομάδα NPE, το χαμηλό σήμα είναι σαφώς ορατό στην ακολουθία T1W και το μικτό σήμα και το χαμηλό σήμα είναι σαφώς ορατά στην ακολουθία T2W. Από την περίοδο των 12 εβδομάδων έως την περίοδο των 20 εβδομάδων, τα σποραδικά υψηλά σήματα που περιβάλλουν τα χαμηλά σήματα στην ακολουθία T2W μειώνονται.
Στην ομάδα NPE παρατηρείται εμφανής υπερπλασία των οστών στο σημείο εμφύτευσης του σπονδυλικού σώματος, και η υπερπλασία των οστών εμφανίζεται ταχύτερα από την 12η έως την 20ή εβδομάδα (Εικ. 2C) σε σύγκριση με την ομάδα NPE, δεν παρατηρείται σημαντική αλλαγή στα μοντελοποιημένα σπονδυλικά σώματα. Ομάδα Ψευδοσκοπίας και ομάδα ME (Εικ. 2C) (2A,B).
(Α) Η επιφάνεια του σπονδυλικού σώματος στο εμφυτευμένο τμήμα είναι πολύ λεία, η οπή επουλώνεται καλά και δεν υπάρχει υπερπλασία στο σπονδυλικό σώμα. (Β) Το σχήμα της εμφυτευμένης θέσης στην ομάδα ME είναι παρόμοιο με αυτό στην ομάδα εικονικής επέμβασης και δεν υπάρχει εμφανής αλλαγή στην εμφάνιση της εμφυτευμένης θέσης με την πάροδο του χρόνου. (Γ) Η οστική υπερπλασία εμφανίστηκε στη θέση εμφύτευσης στην ομάδα NPE. Η οστική υπερπλασία αυξήθηκε ταχέως και μάλιστα επεκτάθηκε μέσω του μεσοσπονδύλιου δίσκου στο ετερόπλευρο σπονδυλικό σώμα.
Η ιστολογική ανάλυση παρέχει πιο λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τον σχηματισμό των οστών. Το Σχήμα 3 δείχνει τις φωτογραφίες των μετεγχειρητικών τομών που έχουν χρωματιστεί με H&E. Στην ομάδα εικονικής επέμβασης, τα χονδροκύτταρα ήταν καλά διατεταγμένα και δεν ανιχνεύθηκε πολλαπλασιασμός κυττάρων (Εικ. 3Α). Η κατάσταση στην ομάδα ME ήταν παρόμοια με αυτήν στην ομάδα εικονικής επέμβασης (Εικ. 3Β). Ωστόσο, στην ομάδα NPE, παρατηρήθηκε μεγάλος αριθμός χονδροκυττάρων και πολλαπλασιασμός κυττάρων που μοιάζουν με NP στο σημείο εμφύτευσης (Εικ. 3C).
(Α) Οι δοκίδες είναι ορατές κοντά στην τελική πλάκα, τα χονδροκύτταρα είναι τακτοποιημένα διατεταγμένα με ομοιόμορφο μέγεθος και σχήμα κυττάρων και χωρίς πολλαπλασιασμό (40 φορές). (Β) Η κατάσταση της θέσης εμφύτευσης στην ομάδα ME είναι παρόμοια με αυτή της εικονικής ομάδας. Οι δοκίδες και τα χονδροκύτταρα είναι ορατά, αλλά δεν υπάρχει εμφανής πολλαπλασιασμός στη θέση εμφύτευσης (40 φορές). (Β) Μπορεί να φανεί ότι τα χονδροκύτταρα και τα κύτταρα που μοιάζουν με νανοσωματίδια πολλαπλασιάζονται σημαντικά και το σχήμα και το μέγεθος των χονδροκυττάρων είναι ανομοιόμορφα (40 φορές).
Η έκφραση του mRNA της ιντερλευκίνης 4 (IL-4), του mRNA της ιντερλευκίνης 17 (IL-17) και του mRNA της ιντερφερόνης γ (IFN-γ) παρατηρήθηκε τόσο στην ομάδα NPE όσο και στην ομάδα ME. Όταν συγκρίθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων-στόχων, οι γονιδιακές εκφράσεις των IL-4, IL-17 και IFN-γ αυξήθηκαν σημαντικά στην ομάδα NPE σε σύγκριση με εκείνες της ομάδας ME και της ομάδας εικονικής επέμβασης (Εικ. 4) (P < 0,05). Σε σύγκριση με την ομάδα εικονικής επέμβασης, τα επίπεδα έκφρασης των IL-4, IL-17 και IFN-γ στην ομάδα ME αυξήθηκαν μόνο ελαφρώς και δεν έφτασαν σε στατιστική αλλαγή (P > 0,05).
Η έκφραση mRNA των IL-4, IL-17 και IFN-γ στην ομάδα NPE έδειξε σημαντικά υψηλότερη τάση από εκείνη στην ομάδα εικονικής επέμβασης και στην ομάδα ME (P < 0,05).
Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης στην ομάδα ME δεν έδειξαν σημαντική διαφορά (P> 0,05).
Η ανάλυση Western blot πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα κατά της IL-4 και της IL-17 για να επιβεβαιωθεί το αλλοιωμένο πρότυπο έκφρασης mRNA. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 5Α,Β, σε σύγκριση με την ομάδα ME και την ομάδα εικονικής επέμβασης, τα επίπεδα πρωτεΐνης της IL-4 και της IL-17 στην ομάδα NPE ήταν σημαντικά αυξημένα (P < 0,05). Σε σύγκριση με την ομάδα εικονικής επέμβασης, τα επίπεδα πρωτεΐνης της IL-4 και της IL-17 στην ομάδα ME επίσης δεν κατάφεραν να επιτύχουν στατιστικά σημαντικές αλλαγές (P> 0,05).
(Α) Τα επίπεδα πρωτεΐνης της IL-4 και της IL-17 στην ομάδα NPE ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά στην ομάδα ME και στην ομάδα εικονικού φαρμάκου (P < 0,05). (Β) Ιστόγραμμα Western blot.
Λόγω του περιορισμένου αριθμού ανθρώπινων δειγμάτων που ελήφθησαν κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης, οι σαφείς και λεπτομερείς μελέτες σχετικά με την παθογένεση του MC είναι κάπως δύσκολες. Προσπαθήσαμε να δημιουργήσουμε ένα ζωικό μοντέλο του MC για να μελετήσουμε τους πιθανούς παθολογικούς μηχανισμούς του. Ταυτόχρονα, χρησιμοποιήθηκαν ακτινολογική αξιολόγηση, ιστολογική αξιολόγηση και μοριακή βιολογική αξιολόγηση για την παρακολούθηση της πορείας του MC που προκαλείται από αυτομόσχευμα NP. Ως αποτέλεσμα, το μοντέλο εμφύτευσης NP είχε ως αποτέλεσμα μια σταδιακή αλλαγή στην ένταση του σήματος από χρονικά σημεία 12 εβδομάδων έως 20 εβδομάδων (μικτό χαμηλό σήμα στις αλληλουχίες T1W και χαμηλό σήμα στις αλληλουχίες T2W), υποδεικνύοντας αλλαγές στους ιστούς, και οι ιστολογικές και μοριακές βιολογικές αξιολογήσεις επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα της ακτινολογικής μελέτης.
Τα αποτελέσματα αυτού του πειράματος δείχνουν ότι εμφανίστηκαν οπτικές και ιστολογικές αλλαγές στο σημείο της παραβίασης του σπονδυλικού σώματος στην ομάδα NPE. Ταυτόχρονα, παρατηρήθηκε η έκφραση των γονιδίων IL-4, IL-17 και IFN-γ, καθώς και των IL-4, IL-17 και IFN-γ, γεγονός που υποδηλώνει ότι η παραβίαση του αυτόλογου ιστού του πηκτοειδούς πυρήνα στο σπονδυλικό σώμα μπορεί να προκαλέσει μια σειρά σημάτων και μορφολογικών αλλαγών. Είναι εύκολο να διαπιστώσουμε ότι τα χαρακτηριστικά σήματος των σπονδυλικών σωμάτων του ζωικού μοντέλου (χαμηλό σήμα στην αλληλουχία T1W, μικτό σήμα και χαμηλό σήμα στην αλληλουχία T2W) είναι πολύ παρόμοια με αυτά των ανθρώπινων σπονδυλικών κυττάρων, και τα χαρακτηριστικά της μαγνητικής τομογραφίας επιβεβαιώνουν επίσης τις παρατηρήσεις της ιστολογίας και της μακροσκοπικής ανατομίας, δηλαδή ότι οι αλλαγές στα κύτταρα του σπονδυλικού σώματος είναι προοδευτικές. Αν και η φλεγμονώδης απόκριση που προκαλείται από οξύ τραύμα μπορεί να εμφανιστεί σύντομα μετά την παρακέντηση, τα αποτελέσματα της μαγνητικής τομογραφίας έδειξαν ότι οι προοδευτικά αυξανόμενες αλλαγές σήματος εμφανίστηκαν 12 εβδομάδες μετά την παρακέντηση και παρέμειναν έως και 20 εβδομάδες χωρίς σημάδια ανάκαμψης ή αντιστροφής των αλλαγών της μαγνητικής τομογραφίας. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αυτόλογη σπονδυλική νανοσωματιδιακή ρινίτιδα (NP) είναι μια αξιόπιστη μέθοδος για την καθιέρωση προοδευτικής MV σε κουνέλια.
Αυτό το μοντέλο παρακέντησης απαιτεί επαρκή δεξιότητα, χρόνο και χειρουργική προσπάθεια. Σε προκαταρκτικά πειράματα, η ανατομή ή η υπερβολική διέγερση των παρασπονδυλικών συνδέσμων μπορεί να οδηγήσει στο σχηματισμό σπονδυλικών οστεοφύτων. Πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να μην προκληθεί βλάβη ή ερεθισμός των παρακείμενων δίσκων. Δεδομένου ότι το βάθος διείσδυσης πρέπει να ελέγχεται για να επιτευχθούν συνεπή και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα, φτιάξαμε χειροκίνητα ένα βύσμα κόβοντας το περίβλημα μιας βελόνας μήκους 3 mm. Η χρήση αυτού του βύσματος εξασφαλίζει ομοιόμορφο βάθος τρυπήματος στο σπονδυλικό σώμα. Σε προκαταρκτικά πειράματα, τρεις ορθοπεδικοί χειρουργοί που συμμετείχαν στην επέμβαση διαπίστωσαν ότι οι βελόνες 16 gauge ήταν πιο εύκολες στη χρήση από τις βελόνες 18 gauge ή άλλες μεθόδους. Για να αποφευχθεί η υπερβολική αιμορραγία κατά τη διάρκεια της τρυπήματος, το να κρατάτε τη βελόνα ακίνητη για λίγο θα παρέχει μια πιο κατάλληλη οπή εισαγωγής, υποδηλώνοντας ότι ένας ορισμένος βαθμός MC μπορεί να ελεγχθεί με αυτόν τον τρόπο.
Παρόλο που πολλές μελέτες έχουν στοχεύσει το MC, λίγα είναι γνωστά για την αιτιολογία και την παθογένεση του MC25,26,27. Με βάση τις προηγούμενες μελέτες μας, διαπιστώσαμε ότι η αυτοανοσία παίζει βασικό ρόλο στην εμφάνιση και ανάπτυξη του MC12. Αυτή η μελέτη εξέτασε την ποσοτική έκφραση των IL-4, IL-17 και IFN-γ, οι οποίες είναι οι κύριες οδοί διαφοροποίησης των κυττάρων CD4+ μετά από διέγερση με αντιγόνο. Στη μελέτη μας, σε σύγκριση με την αρνητική ομάδα, η ομάδα NPE είχε υψηλότερη έκφραση IL-4, IL-17 και IFN-γ, και τα επίπεδα πρωτεΐνης της IL-4 και της IL-17 ήταν επίσης υψηλότερα.
Κλινικά, η έκφραση mRNA της IL-17 αυξάνεται σε κύτταρα νανοσωματιδίων (NP) από ασθενείς με κήλη δίσκου28. Αυξημένα επίπεδα έκφρασης IL-4 και IFN-γ βρέθηκαν επίσης σε ένα μοντέλο οξείας μη συμπιεστικής κήλης δίσκου σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες29. Η IL-17 παίζει βασικό ρόλο στη φλεγμονή, την ιστική βλάβη σε αυτοάνοσα νοσήματα30 και ενισχύει την ανοσολογική απόκριση στην IFN-γ31. Αυξημένη ιστική βλάβη που προκαλείται από την IL-17 έχει αναφερθεί σε ποντίκια MRL/lpr32 και σε ποντίκια ευαίσθητα σε αυτοάνοσα νοσήματα33. Η IL-4 μπορεί να αναστείλει την έκφραση προφλεγμονωδών κυτοκινών (όπως η IL-1β και ο TNFα) και την ενεργοποίηση μακροφάγων34. Αναφέρθηκε ότι η έκφραση mRNA της IL-4 ήταν διαφορετική στην ομάδα NPE σε σύγκριση με την IL-17 και την IFN-γ στο ίδιο χρονικό σημείο. Η έκφραση mRNA της IFN-γ στην ομάδα NPE ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτή στις άλλες ομάδες. Επομένως, η παραγωγή IFN-γ μπορεί να είναι ένας μεσολαβητής της φλεγμονώδους απόκρισης που προκαλείται από την παρεμβολή νανοσωματιδίων. Μελέτες έχουν δείξει ότι η IFN-γ παράγεται από πολλαπλούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ενεργοποιημένων βοηθητικών Τ κυττάρων τύπου 1, των φυσικών κυττάρων-δολοφόνων και των μακροφάγων35,36, και είναι μια βασική προφλεγμονώδης κυτοκίνη που προάγει τις ανοσολογικές αποκρίσεις37.
Αυτή η μελέτη υποδηλώνει ότι η αυτοάνοση απόκριση μπορεί να εμπλέκεται στην εμφάνιση και ανάπτυξη του MC. Οι Luoma et al. διαπίστωσαν ότι τα χαρακτηριστικά σήματος του MC και των εμφανών νανοσωματιδίων είναι παρόμοια στην MRI και αμφότερα δείχνουν υψηλό σήμα στην αλληλουχία T2W38. Ορισμένες κυτοκίνες έχουν επιβεβαιωθεί ότι σχετίζονται στενά με την εμφάνιση του MC, όπως η IL-139. Οι Ma et al. υπέδειξαν ότι η ανοδική ή καθοδική προεξοχή των νανοσωματιδίων μπορεί να έχει μεγάλη επίδραση στην εμφάνιση και ανάπτυξη του MC12. Οι Bobechko40 και Herzbein et al.41 ανέφεραν ότι οι νανοσωματίδια είναι ένας ανοσοανεκτικός ιστός που δεν μπορεί να εισέλθει στην αγγειακή κυκλοφορία από τη γέννηση. Οι προεξοχές των νανοσωματιδίων εισάγουν ξένα σώματα στην παροχή αίματος, μεσολαβώντας έτσι σε τοπικές αυτοάνοσες αντιδράσεις42. Οι αυτοάνοσες αντιδράσεις μπορούν να προκαλέσουν μεγάλο αριθμό ανοσολογικών παραγόντων και όταν αυτοί οι παράγοντες εκτίθενται συνεχώς στους ιστούς, μπορούν να προκαλέσουν αλλαγές στη σηματοδότηση43. Σε αυτή τη μελέτη, η υπερέκφραση των IL-4, IL-17 και IFN-γ είναι τυπικοί ανοσολογικοί παράγοντες, αποδεικνύοντας περαιτέρω τη στενή σχέση μεταξύ νανοσωματιδίων και νανοσωματιδίων44. Αυτό το ζωικό μοντέλο μιμείται καλά τη διάσπαση των νανοσωματιδίων και την είσοδο στην τελική πλάκα. Αυτή η διαδικασία αποκάλυψε περαιτέρω την επίδραση της αυτοανοσίας στο MC.
Όπως αναμενόταν, αυτό το ζωικό μοντέλο μας παρέχει μια πιθανή πλατφόρμα για τη μελέτη του MC. Ωστόσο, αυτό το μοντέλο εξακολουθεί να έχει ορισμένους περιορισμούς: πρώτον, κατά τη φάση παρατήρησης των ζώων, ορισμένα κουνέλια ενδιάμεσου σταδίου πρέπει να υποβληθούν σε ευθανασία για ιστολογικές και μοριακές βιολογικές εξετάσεις, επομένως ορισμένα ζώα «παύουν να είναι χρησιμοποιήσιμα» με την πάροδο του χρόνου. Δεύτερον, παρόλο που σε αυτή τη μελέτη ορίζονται τρία χρονικά σημεία, δυστυχώς, μοντελοποιήσαμε μόνο έναν τύπο MC (αλλαγή τύπου Ι κατά Modic), επομένως δεν αρκεί για να αναπαραστήσει τη διαδικασία ανάπτυξης της ανθρώπινης νόσου και πρέπει να οριστούν περισσότερα χρονικά σημεία για να παρατηρηθούν καλύτερα όλες οι αλλαγές σήματος. Τρίτον, οι αλλαγές στη δομή των ιστών μπορούν πράγματι να φανούν σαφώς με ιστολογική χρώση, αλλά ορισμένες εξειδικευμένες τεχνικές μπορούν να αποκαλύψουν καλύτερα τις μικροδομικές αλλαγές σε αυτό το μοντέλο. Για παράδειγμα, η μικροσκοπία πολωμένου φωτός χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του σχηματισμού ινοχόνδρου σε μεσοσπονδύλιους δίσκους κουνελιού45. Οι μακροπρόθεσμες επιπτώσεις των NP στο MC και την τελική πλάκα απαιτούν περαιτέρω μελέτη.
Πενήντα τέσσερα αρσενικά λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας (βάρους περίπου 2,5-3 κιλά, ηλικίας 3-3,5 μηνών) χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδα εικονικής επέμβασης, ομάδα εμφύτευσης μυών (ομάδα ME) και ομάδα εμφύτευσης νευρικής ρίζας (ομάδα NPE). Όλες οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Νοσοκομείου Tianjin και οι πειραματικές μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με αυστηρά τις εγκεκριμένες οδηγίες.
Έχουν γίνει κάποιες βελτιώσεις στην χειρουργική τεχνική του S. Sobajima 46. Κάθε κουνέλι τοποθετήθηκε σε πλάγια κατάκλιση και η πρόσθια επιφάνεια πέντε διαδοχικών οσφυϊκών μεσοσπονδύλιων δίσκων (IVDs) αποκαλύφθηκε χρησιμοποιώντας οπισθοπλάγια οπισθοπεριτοναϊκή προσέγγιση. Σε κάθε κουνέλι χορηγήθηκε γενική αναισθησία (20% ουρεθάνη, 5 ml/kg μέσω της φλέβας του αυτιού). Έγινε διαμήκης τομή του δέρματος από το κάτω άκρο των πλευρών έως το πυελικό χείλος, 2 cm κοιλιακά από τους παρασπονδυλικούς μύες. Η δεξιά πρόσθια πλάγια σπονδυλική στήλη από τον Ο1 έως τον Ο6 αποκαλύφθηκε με οξεία και αμβλεία ανατομή του υπερκείμενου υποδόριου ιστού, του οπισθοπεριτοναϊκού ιστού και των μυών (Εικ. 6Α). Το επίπεδο του δίσκου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το πυελικό χείλος ως ανατομικό ορόσημο για το επίπεδο του δίσκου Ο5-Ο6. Χρησιμοποιήστε μια βελόνα παρακέντησης 16-gauge για να ανοίξετε μια οπή κοντά στην τελική πλάκα του σπονδύλου Ο5 σε βάθος 3 mm (Εικ. 6Β). Χρησιμοποιήστε μια σύριγγα 5 ml για να αναρροφήσετε τον αυτόλογο πηκτοειδή πυρήνα στον μεσοσπονδύλιο δίσκο L1-L2 (Εικ. 6C). Αφαιρέστε τον πηκτοειδή πυρήνα ή τον μυ ανάλογα με τις απαιτήσεις κάθε ομάδας. Αφού βαθύνει η οπή, τοποθετούνται απορροφήσιμα ράμματα στην εν τω βάθει περιτονία, την επιφανειακή περιτονία και το δέρμα, προσέχοντας να μην προκληθεί βλάβη στον περιοστικό ιστό του σπονδυλικού σώματος κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης.
(Α) Ο δίσκος L5–L6 αποκαλύπτεται μέσω οπισθοπλάγιας οπισθοπεριτοναϊκής προσέγγισης. (Β) Χρησιμοποιήστε βελόνα 16 gauge για να ανοίξετε μια οπή κοντά στην τελική πλάκα L5. (Γ) Λαμβάνονται αυτόλογα MF.
Χορηγήθηκε γενική αναισθησία με 20% ουρεθάνη (5 ml/kg) μέσω της φλέβας του ωτός και οι ακτινογραφίες της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης επαναλήφθηκαν στις 12, 16 και 20 εβδομάδες μετεγχειρητικά.
Τα κουνέλια θυσιάστηκαν με ενδομυϊκή ένεση κεταμίνης (25,0 mg/kg) και ενδοφλέβια πεντοβαρβιτάλη νατρίου (1,2 g/kg) στις 12, 16 και 20 εβδομάδες μετά την επέμβαση. Ολόκληρη η σπονδυλική στήλη αφαιρέθηκε για ιστολογική ανάλυση και πραγματοποιήθηκε πραγματική ανάλυση. Χρησιμοποιήθηκαν ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή (RT-qPCR) και Western blotting για την ανίχνευση αλλαγών σε ανοσολογικούς παράγοντες.
Οι εξετάσεις μαγνητικής τομογραφίας πραγματοποιήθηκαν σε κουνέλια χρησιμοποιώντας έναν κλινικό μαγνήτη 3,0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) εξοπλισμένο με έναν ορθογώνιο δέκτη πηνίου άκρου. Τα κουνέλια αναισθητοποιήθηκαν με 20% ουρεθάνη (5 mL/kg) μέσω της φλέβας του αυτιού και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ύπτια θέση μέσα στον μαγνήτη με την οσφυϊκή περιοχή κεντραρισμένη σε ένα κυκλικό πηνίο επιφάνειας διαμέτρου 5 ιντσών (GE Medical Systems). Ελήφθησαν εικόνες εντοπισμού στεφανιαίου Τ2 (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) για να προσδιοριστεί η θέση του οσφυϊκού δίσκου από L3–L4 έως L5–L6. Ελήφθησαν τομές T2 με στάθμιση στο οβελιαίο επίπεδο με τις ακόλουθες ρυθμίσεις: γρήγορη ακολουθία spin-echo με χρόνο επανάληψης (TR) 2200 ms και χρόνο ηχούς (TE) 70 ms, μήτρα· οπτικό πεδίο 260 και οκτώ ερεθίσματα· το πάχος κοπής ήταν 2 mm, το κενό ήταν 0,2 mm.
Αφού τραβήχτηκε η τελευταία φωτογραφία και θανατώθηκε το τελευταίο κουνέλι, οι ψεύτικοι δίσκοι, οι δίσκοι με ενσωματωμένους μυς και οι δίσκοι NP αφαιρέθηκαν για ιστολογική εξέταση. Οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης 10% για 1 εβδομάδα, απασβεστώθηκαν με αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ και τομογραφήθηκαν με παραφίνη. Τα μπλοκ ιστού ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και κόπηκαν σε οβελιαίες τομές (πάχους 5 μm) χρησιμοποιώντας μικροτόμο. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (H&E).
Μετά τη συλλογή των μεσοσπονδύλιων δίσκων από τα κουνέλια κάθε ομάδας, το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας στήλη UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ένα σύστημα αντίστροφης μεταγραφής ImProm II (Promega Inc., Madison, WI, ΗΠΑ). Πραγματοποιήθηκε αντίστροφη μεταγραφή.
Η RT-qPCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ΗΠΑ) και SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο όγκος αντίδρασης PCR ήταν 20 μl και περιείχε 1,5 μl αραιωμένου cDNA και 0,2 μM από κάθε εκκινητή. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν από την OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) και κατασκευάστηκαν από την Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Κίνα) (Πίνακας 1). Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες συνθήκες θερμικού κύκλου: αρχικό βήμα ενεργοποίησης πολυμεράσης στους 94°C για 2 λεπτά, στη συνέχεια 40 κύκλοι των 15 s ο καθένας στους 94°C για μετουσίωση του προτύπου, ανόπτηση για 1 λεπτό στους 60°C, επέκταση και φθορισμό. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν για 1 λεπτό στους 72°C. Όλα τα δείγματα ενισχύθηκαν τρεις φορές και η μέση τιμή χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση RT-qPCR. Τα δεδομένα ενίσχυσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ΗΠΑ). Η έκφραση των γονιδίων IL-4, IL-17 και IFN-γ ομαλοποιήθηκε ως προς τον ενδογενή έλεγχο (ACTB). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA-στόχου υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCT.
Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από τους ιστούς χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή ιστών σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA (που περιείχε ένα κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης και φωσφατάσης) και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 13.000 rpm για 20 λεπτά στους 4°C για την απομάκρυνση των υπολειμμάτων των ιστών. Πενήντα μικρογραμμάρια πρωτεΐνης φορτώθηκαν ανά λωρίδα, διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Ο αποκλεισμός πραγματοποιήθηκε σε 5% άπαχο γάλα σε σκόνη σε αλατούχο διάλυμα Tris (TBS) που περιείχε 0,1% Tween 20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού κατά της δεκορίνης (αραιωμένο 1:200· Boster, Wuhan, Κίνα) (αραιωμένο 1:200· Bioss, Πεκίνο, Κίνα) όλη τη νύχτα στους 4°C και αντέδρασε τις δεύτερες ημέρες. με δευτερογενές αντίσωμα (ανοσοσφαιρίνη G κατσίκας κατά κουνελιού σε αραίωση 1:40.000) σε συνδυασμό με υπεροξειδάση χρένου (Boster, Wuhan, China) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα σήματα Western blot ανιχνεύθηκαν με αυξημένη χημειοφωταύγεια στη χημειοφωταύγεια μεμβράνη μετά από ακτινοβολία με ακτίνες Χ. Για πυκνομετρική ανάλυση, τα στυπώματα σαρώθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό BandScan και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο λόγος της ανοσοαντιδραστικότητας του γονιδίου-στόχου προς την ανοσοαντιδραστικότητα της τουμπουλίνης.
Οι στατιστικοί υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού SPSS16.0 (SPSS, ΗΠΑ). Τα δεδομένα που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της μελέτης εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονοκατευθυντική ανάλυση διακύμανσης επαναλαμβανόμενων μετρήσεων (ANOVA) για τον προσδιορισμό των διαφορών μεταξύ των δύο ομάδων. Το P < 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντικό.
Έτσι, η δημιουργία ενός ζωικού μοντέλου MC με την εμφύτευση αυτόλογων νανοσωματιδίων στο σπονδυλικό σώμα και την εκτέλεση μακροανατομικής παρατήρησης, ανάλυσης MRI, ιστολογικής αξιολόγησης και μοριακής βιολογικής ανάλυσης μπορεί να αποτελέσει ένα σημαντικό εργαλείο για την αξιολόγηση και κατανόηση των μηχανισμών του ανθρώπινου MC και την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παρεμβάσεων.
Πώς να αναφέρετε αυτό το άρθρο: Han, C. et al. Ένα ζωικό μοντέλο αλλαγών Modic δημιουργήθηκε με εμφύτευση αυτόλογου πηκτοειδούς πυρήνα στο υποχόνδριο οστό της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., και Boos, N. Μαγνητική τομογραφία της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης: συχνότητα εμφάνισης κήλης και κατακράτησης δίσκου, συμπίεσης νευρικής ρίζας, ανωμαλιών της τελικής πλάκας και οστεοαρθρίτιδας των ζυγοαποφυσιακών αρθρώσεων σε ασυμπτωματικούς εθελοντές. ποσοστό. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, και Leboeuf-Eed, K. Αλλαγές Modic και η σχέση τους με τα κλινικά ευρήματα. European Spine Journal: επίσημη δημοσίευση της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Σπονδυλικής Στήλης, της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Παραμόρφωσης της Σπονδυλικής Στήλης και της Ευρωπαϊκής Εταιρείας για την Έρευνα της Αυχενικής Μοίρας της Σπονδυλικής Στήλης 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Αλλαγές Modic στις τελικές πλάκες της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης: συχνότητα εμφάνισης και συσχέτιση με πόνο στην πλάτη και ισχιαλγία σε άνδρες εργαζόμενους μέσης ηλικίας. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., και Dalinka, M. MRI αλλαγών μυελού των οστών κοντά στην τελική πλάκα σε εκφυλιστική νόσο της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, και Carter, JR Εκφυλιστική νόσος του δίσκου: αξιολόγηση των αλλοιώσεων του μυελού της σπονδυλικής στήλης με μαγνητική τομογραφία. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, και Carter, JR Απεικόνιση εκφυλιστικής νόσου δίσκου. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Προγνωστικοί παράγοντες της νεοσπονδυλικής τελικής πλάκας (Modic) σηματοδοτούν αλλαγές στον γενικό πληθυσμό. European Spine Journal: Επίσημη Έκδοση της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Σπονδυλικής Στήλης, της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Σπονδυλικής Παραμόρφωσης και της Ευρωπαϊκής Εταιρείας για την Έρευνα της Αυχενικής Μοίρας της Σπονδυλικής Στήλης, Τμήμα 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB και Mannisch, K. Αλλαγές Modic μετά από κήλη οσφυϊκού δίσκου. European Spine Journal: Επίσημη Έκδοση της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Σπονδυλικής Στήλης, της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Παραμόρφωσης της Σπονδυλικής Στήλης και της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Έρευνας της Αυχενικής Μοίρας της Σπονδυλικής Στήλης 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., και Kaapa, E. Οι αλλαγές τύπου Ι του Modic μπορούν να προβλέψουν την ταχέως εξελισσόμενη παραμορφωτική εκφύλιση του δίσκου: μια μονοετής προοπτική μελέτη. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ και Fan, SW Αλλαγές Modic: πιθανές αιτίες και συμβολή στην εκφύλιση του οσφυϊκού δίσκου. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Ρήξη εσωτερικού δίσκου. Προβλήματα πρόπτωσης δίσκου άνω των 50 ετών. Σπονδυλική στήλη (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Ώρα δημοσίευσης: 13 Δεκεμβρίου 2024